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蛋白质需要维持特定的结构才能正常发挥生理功能。蛋白质的不正常聚集沉淀导致了一系列疾病的发生。分子伴侣在生物体内广泛存在,从多个方面参与了维持蛋白质稳态:帮助未折叠的蛋白进行折叠,或者是结合错误折叠的蛋白,甚至参与解聚一些已经形成沉淀的蛋白帮助其重折叠,从而抑制了生物体内的蛋白质聚集沉淀。分子伴侣因此成为神经退行性疾病或癌症治疗的重要靶标。但是目前对于分子伴侣的了解仍不够深入,一些分子伴侣的工作机制非常复杂,不利于发现影响分子伴侣活性关键因素。因此,本论文通过研究存在于大肠杆菌中的分子伴侣Spy,阐释了 Spy发挥分子伴侣活性的机制,为研究其他复杂分子伴侣提供了帮助。本论文的研究主要涉及了三个部分。在第一部分中,我们首先证明了静电作用是影响分子伴侣活性的重要因素。我们在大肠杆菌中表达、纯化了4个表面正电荷增强的突变体,即Spy Q49R,Spy Q52R,Spy H96R与SpyQ100R,这些突变体的分子伴侣活性较野生型Spy至少提升1.9倍。随后,我们发现随盐浓度升高,突变体的分子伴侣活性降低,且在高盐浓度下突变体相较于野生型不再具有活性优势。最后,我们将这4个位点突变为带负电荷的谷氨酸,再次进行体外分子伴侣活性测试。我们发现4个谷氨酸突变体均表现出弱于野生型的分子伴侣活性,这进一步表明静电作用是影响Spy分子伴侣活性的重要因素。之前的研究表明,Spy N端无序区域(1-28号氨基酸残基)可通过D26残基促进底物释放,然而N端无序区域促进底物释放的具体作用机制尚不清楚。在第二部分中,我们主要通过顺磁驰豫增强(Paramagnetic Relaxation Enhancement,PRE)技术证明了 Spy N端无序区域主要通过D26残基与Spy主体结构区域进行静电相互作用,从而竞争性的促进底物释放。此外,通过结合突变手段与PRE实验,我们还鉴定出了 Spy N端无序区域在Spy主体结构上的相互作用位点即K54,R55和R89。在第三部分中,我们主要建立了 Spy异源二聚体的表达纯化方法,为后续利用单分子荧光共振能量转移技术(single molecule fluorescence resonance energy transfer,smFRET)研究Spy N末端无序区域的动态运动方式奠定了基础。