草菇漆酶基因异源表达的研究

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漆酶是一种含铜的蓝色多酚氧化酶。它以铜作为辅基,以氧分子作为氧化剂,催化氧化含自由酚基的化合物。漆酶的结构使它具有底物广泛性。因此,漆酶不仅在自然界中对动植物及真菌体内发挥着作用,而且在现代工业中也有广泛的应用,如食品工业、造纸工业以及环境保护、生物传感器等领域。然而漆酶在自然界中的产量低,没有充足的酶源和昂贵的生产成本阻碍了漆酶的应用。草菇是众多产漆酶的白腐菌中的一种,草菇全基因组测序的完成以及11个漆酶基因的生物信息学分析,对草菇漆酶的研究和开发奠定了基础。本研究以草菇中6个漆酶基为研究对象,对草菇漆酶基因进行克隆并初步建立异源表达体系。研究的主要结论如下:1.采用Redzol一步法从草菇菌丝中提取草菇基因组RNA并反转录成cDNA。2.对目的基因vv-lac1、vv-lac4、vv-lac5、vv-lac6、vv-lac8和vv-lac9经PCR扩增,产物纯化后克隆到pMD19-T载体和表达载体pPIC9K中。3.采用电击法将目的基因分别转化到毕赤酵母GS115中,对重组子进行漆酶活性的筛选。结果表明,仅有带有草菇漆酶lac6基因的重组子(L6/G)具有漆酶活性。4.对10个L6/G重组子进行多克隆筛选,获得两个菌株L6/G-1和L6/G-2。摇瓶发酵,以ABTS底物检测法检测蛋白的漆酶活性,两个菌株的漆酶活性分别为0.22U/L和0.35U/L。
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