论文部分内容阅读
CYP3A4是人类最重要的Ⅰ相药物代谢酶,约占成人肝脏中药物代谢酶的60%,参与半数以上临床用药的体内代谢过程,且CYP3A4的酶活性决定其靶药物的体内代谢速率。CYP3A4的表达受到环境和遗传因素的共同影响,但CYP3A4酶活性个体差异的90%来源于遗传因素,现有基因变异的研究结果不能充分解释CYP3A4的个体化差异。miRNA作为基因转录后的重要调控因子,有研究从细胞水平证实了niRNA-27b能直接作用于CYP3A4的3’-UTR,下调CYP3A4的表达,但关于miRNA-27b是否在人类肝脏中调控CYP3A4的表达未做出确切解答,其他的miRNA在CYP3A4表达调控中的作用还知之甚少。研究目的筛查可能调控CYP3A4基因表达的miRNA,及其在人类肝脏组织中对YP3A4的mRNA、蛋白水平和酶活性的影响；探讨miRNA-27b是否在人类肝脏组织中调控CYP3A4表达水平。方法和结果(1)采用三种软件预测可能作用于CYP3A4基因3’-UTR的miRNA,共预测出108种miRNA。(2)通过高通量转染实验和荧光色素酶报告实验从108种miRNA中筛选出阳性miRNA12种。并从中选择了niRNA-660做进一步的功能验证,miRNA-660可明显抑制萤光素酶活性,使其降低35%。(3)收集到28例人类肝脏组织,通过LNA标记的miRNA特异引物及SYBRGreen实时荧光定量PCR,检钡miRNA-660和miRNA-27b在肝脏组织中的表达量,结果显示两种miRNA的表达水平在28个样本中存在明显差异。(4) SYBR Green实时荧光定量PCR检测肝脏组织中CYP3A4的mRNA量,western blot检测CYP3A4蛋白量,HPLC检测CYP3A4酶活性,将三种表达水平与niRNA-660、miR-27b的表达值进行相关性分析,结果显示miRNA-660与肝脏组织中CYP3A4的蛋白、酶活性显著负相关(p<0.05),与mRNA无显著相关性(p>0.05)；miRNA-27b与肝脏组织中CYP3A4的mRNA、蛋白水平、酶活性均无显著相关性(p>0.05)。结论(1) miRNA-660可能参与了人类肝脏组织中CYP3A4基因的表达调控,机制可能与抑CYP3A4基因mRNA的翻译有关；(2) miRNA-27b和人肝脏组织CYP3A4的表达水平没有明显相关性。