论文部分内容阅读
番鸭呼肠孤病毒病是番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus,MDRV）感染引起的一种番鸭病毒性传染病。该病临床症状主要表现为瘫痪,剖检典型病变为肝脏表面灰白色斑点。自2021年以来,在我国山东、河南、江苏等主要鹅养殖地区爆发以瘫痪,全身各组织器官有大量白色坏死斑点为主要特征的传染性疾病,严重阻碍了中国鹅产业的健康快速发展。本研究从自然感染鹅的脾脏组织样品中分离得到12株鹅MDRV,从分离株中选择HN21株病毒进行致病性研究。针对该病发病特点建立了Taq Man探针荧光定量RT-PCR检测方法,并利用该方法检测了不同日龄雏鹅感染该病毒后不同组织器官中病毒的分布、排毒规律及病毒血症情况,为防控鹅番鸭呼肠孤病毒病提供了理论依据。本研究从河南、江苏和辽宁等地区疑似番鸭呼肠孤病毒感染的发病鹅群中采集病料样品,分离得到12株病毒,对分离株σC基因进行测定,确定12株分离株为鹅源番鸭呼肠孤病毒,并与NCBI的禽呼肠孤σC基因进行遗传进化分析,结果表明12株分离株之间同源性较高,核苷酸同源性在97.9%～100%之间,推导的氨基酸同源性在98.1%～100%之间;12株毒株之间有16个碱基不同,在第337～340、791～798个碱基变化较大;12株毒株之间的氨基酸序列存在8处差异。12株分离株与经典株ZJ2000M同源性最高,核苷酸的同源性在95.4%～96.7%之间,氨基酸同源性在95.2%～96.7%之间。与经典株ZJ2000M核苷酸序列相比,存在45处不同,12株毒株的氨基酸与经典株ZJ2000M序列相比,有18个氨基酸发生变化。遗传进化树显示,12株分离株仍与水禽衍生的ARV处于相同的进化谱系中,与之前报道的ZJ2000M毒株关系最密切。根据鹅源MDRV S4基因序列设计了扩增长度为154bp的特异性引物和探针。利用p MD18-T载体构建含有目的片段的重组质粒,鉴定成功后,10倍稀释制备标准品质粒;以标准品质粒为模板进行反应条件的优化并构建标准曲线,建立检测鹅源MDRV的Taq Man探针荧光定量RT-PCR方法。该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于鹅源MDRV感染的早期定性与定量诊断。本研究从分离株中选择HN21株病毒对不同日龄雏鹅进行致病性研究,分别通过口服和肌内注射途径感染实验组的雏鹅,每只接种0.5 mL(TCID50为10-6.51/0.1mL)病毒液,空白对照组中的雏鹅接种相同剂量的生理盐水。观察并记录感染雏鹅的临床表现,人工感染雏鹅后第1d、2 d、4 d、7 d、11 d、16 d和22 d,随机选取每组雏鹅3只称量并记录体重。于各组随机采集泄殖腔棉拭子和血液样品各3份,检测雏鹅泄殖腔和血液中的排毒情况。采集病变组织固定,进行病理组织学研究,同时收取各组织器官进行病毒载量的测定。研究结果显示,不同感染日龄雏鹅临床症状相似。剖检变化表现为,10日龄攻毒组雏鹅全身多处组织器官出现白色坏死斑点,主要包括肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺和肠道等。此外,发病雏鹅还出现关节肿大,关节腔内出血等剖检变化;20日龄攻毒组雏鹅剖检变化与10日龄攻毒组大体一致,但程度较轻;30日龄攻毒组仅在肝脏、脾脏出现白色坏死斑点,其他组织器官未出现。上述结果表明,该病毒的感染力与感染日龄密切相关,感染雏鹅日龄越小,发病程度越严重。病理组织学结果显示,各攻毒组雏鹅表现为全身组织器官的严重损伤,其中肝脏、脾脏和肾脏坏死最严重,并伴有炎性细胞浸润。不同日龄健康雏鹅感染鹅源番鸭呼肠孤病毒后,体重增长均受到影响。血液中病毒载量与棉拭子排毒规律结果显示,不同日龄鹅在感染早期均出现病毒血症和泄殖腔排毒情况。不同组织病毒载量检测结果显示,不同日龄实验组雏鹅各组织器官在攻毒后1d均能检测到鹅源番鸭呼肠孤病毒,其中以脾脏和肝脏中病毒含量较高,小日龄攻毒组鹅的病毒载量高于大日龄攻毒组。上述结果说明MDRV对不同日龄雏鹅的感染力存在差异,感染日龄越小,对鹅的致病性越强。综合MDRV在雏鹅体内的动态分布,可为预防和控制鹅呼肠孤病毒病提供可靠的理论依据。