T细胞功能耗竭是持续性HBV感染的一个重要特征。长期的大量的抗原刺激是导致CHB患者T细胞功能耗竭的一个重要原因，研究表明CD28家族抑制性受体，特别是PD-1在慢乙肝患者耗竭的CD8+T细胞上的表达增加。CD28家族包含两个协同刺激性受体（CD28和ICOS），三个抑制性受体（PD-1、CTLA-4和BTLA）。CD28家族五个受体具有同源性，在结构上具有类似特征，且都是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。尽管这些受体在HIV和HCV持续感染已有大量的研究，但在持续性HBV感染中的作用研究相对较少，所积累的临床科研资料更是匮乏。本研究拟以整个CD28家族作为研究对象，探讨它们在持续性HBV感染中外周血T细胞上表达状况及与血清病毒学指标的相关性，以及体外阻断PD-1:PD-L1路径对HBV持续性感染患者CD4+和CD8+T细胞CD28家族受体表达的影响和T细胞功能的影响。本研究对探讨新的慢乙肝的免疫治疗方法将具有重要意义。目的1.本研究期望通过对CD28家族中的受体（CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4和BTLA）在HBV持续性感染患者外周血T细胞上表达状况进行研究，并分析这些分子的表达与CHB患者血清病毒学指标的相关性。2.通过体外阻断PD-1:PD-L1路径，PBMC在体外培养并用HBV特异性多肽,即HLA-A2限制性多肽（AA，18-27，FLPSDFFPSI)刺激，确定阻断前后HBV持续性感染患者CD4+和CD8+T细胞CD28家族受体表达情况变化，根据表达量的变化，判断阻断效果并结合临床指标来评价CD28家族中的受体对HBV持续性感染患者T细胞功能耗竭的影响。3.根据阻断后T细胞表达效应细胞因子IFN-γ及mRNA水平上表达的转录因子T-bet和GATA-3综合判定PD-1:PD-L1路径阻断对CHB患者T细胞功能的影响。探讨CHB患者T细胞功能耗竭的可能机制，并从总体上阐明CD28家族中的抑制性受体在持续性HBV感染中的作用。为我们将来找到治疗HBV持续性感染手段提供一定的参考。方法1.总共48位来源于协和感染性疾病科慢性乙肝患者和26位健康者参与这项研究。2.肝素抗凝管采取新鲜血液，用泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)密度梯度离心法分离PBMC。分离后的PBMC立即染色进行表型分析。3.分离后的部分PBMC在96孔（2×105/孔）圆底板上培养10天，并根据需要加入HBV特异性多肽,即HLA-A2限制性多肽（AA，18-27，FLPSDFFPSI)刺激，并加入Anti-PD-L1用于阻断PD-1:PD-L1路径,实验中还需另外加入同型质控抗体作为对照。培养后的细胞用于一部分用于流式检测CD4+和CD8+T细胞表面CD28家族受体（CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4、BTLA）和胞内效应细胞因子IFN-γ的表达；部分PBMC用real-time PCR定量检测总体的mRNA水平上T细胞转录因子：T-bet和GATA-3表达。4.用商业化的酶联免疫分析试剂盒检测血清学标志物：HBsAg、anti-HBsAg、HBeAg、anti-HBeAg、anti-HBcAg、anti-HIV（1/2型）、anti-HCV、anti-HDV；用PCR方法进行HLA-A2型别的鉴定；血清中的HBV-DNA用实时定量PCR（real-time PCR）进行定量。5.统计学分析采用非参数Mann-Whitney, Wilcoxon matched pairs检验和Spearman correlation coefficient检验。结果1. CD28家族受体总体表达谱不同于健康对照组：相对于正常对照，CHB患者的CD4+T细胞的PD-1、CTLA-4和CD8+T细胞上的ICOS、PD-1和BTLA均显著升高。2. CHB患者和健康对照相比，CD28家族同一受体在CD4+和CD8+T细胞上表达的相关性存在差异：CD28、ICOS、PD-1在CHB患者CD4+与CD8+T细胞上的表达表现为正相关，但在健康对照组上CD4+与CD8+T细胞上的表达不相关。但BTLA在健康对照和CHB患者的CD4+与CD8+T细胞上的表达均表现出很好的正相关。3. CHB患者和健康对照相比，CD28家族不同受体在同一CD4+或CD8+T表达之间的表达存在差异：CD28与CTLA-4在CHB患者CD4+上的表达成负相关，但在健康对照CD4+T细胞上的表达不相关；ICOS与PD-1在CHB患者和健康对照上CD4+T细胞上均表现为正相关；CD28与BTLA在CHB患者CD8+上的表达和健康对照CD8+T细胞上的表达上均成正相关。4. CHB患者CD8+T细胞上的ICOS、PD-1和BTLA的表达和患者血清中的HBV DNA载量存在相关性，即：HBV DNA载量分别与PD-1、BTLA成正相关，而与ICOS成负相关。5. CHB患者CD4+和CD8+T细胞在体外PD-1:PD-L1路径阻断后：（1）总体的CD28家族受体的表达谱发生显著改变，CD4+细胞上CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4的表达显著上调，且CD4+T细胞上的CD28和ICOS倍数改变成正相关，CD4+T细胞上的CTLA-4分别同CD28、ICOS、PD-1均成正相关。但CD8+T细胞上CD28家族受体的表达没有显著变化。另外，PD-1:PD-L1路径阻断后CD4+细胞上PD-1的表达与HBV DNA载量成正相关。（2）CD4+胞内IFN-γ表达升高，且其倍数改变与阻断后CD4+T细胞上ICOS表达的倍数改变成正相关，而与CD4+T细胞上PD-1表达的倍数改变成负相关；CD8+T细胞在PD-1:PD-L1路径阻断后，胞内IFN-γ表达没有显著改变。（3）总体的PBMC转录因子T-bet和GATA-3mRNA表达上调，且两者的倍数改变成正相关，但T-bet的倍数改变更为明显；PD-1:PD-L1路径阻断后，T-bet:GATA-3>1.3时，CD4+T细胞胞内IFN-γ表达较T-bet:GATA-3<1.3时更高。结论1.与健康对照相比，CHB患者CD4+或CD8+T细胞上CD28家族中某些受体的表达量及不同受体在同一细胞或同一细胞表达不同受体的相关性上发生改变，提示这些变化可能是CD28家族受体在CHB患者T细胞上表达的生物学特征，或是其发生功能耗竭的原因。2. CHB患者CD8+T细胞上的PD-1和BTLA的表达和患者血清中的HBV DNA载量存在正相关，而ICOS与HBV DNA载量存在负相关，提示这三个分子与HBV在体内的复制可能互为因果关系。提示我们将来利用可利用这三个分子作为靶标作为研究对象，为其最终用于临床治疗提供参考。3.体外阻断PD-1:PD-L1路径，可引起T细胞上CD28家族受体的表达发生变化，并且不同受体之间和受体与HBV DNA水平存在相互联系，提示我们运用经典PD-1:PD-L1或其它新的阻断路径的同时，要充分考虑由其带来的其它分子的消长变化所带来的影响，从而对阻断效果作慎重评估。4.体外阻断PD-1:PD-L1路径，只能使CD4+胞内IFN-γ表达升高，而CD8+T细胞胞内IFN-γ表达没有显著改变，且CD4+胞内IFN-γ倍数改变与其细胞上ICOS表达的倍数改变成正相关，而与PD-1表达的倍数改变成负相关，提示我们将来用单一PD-1:PD-L1路径阻断方法用于CHB患者治疗作用有限，且要根据其它分子的表达状况，考虑是否采用或选择最佳时机。5.体外PD-1:PD-L1路径阻断能使CHB患者总体的T细胞胞内转录因子T-betmRNA表达水平相对于GATA-3mRNA水平升高更为显著，且T-bet:GATA-3比率较大时更有利于CD4+T细胞胞内IFN-γ表达。本研究的创新点1.本项目立于国际前沿研究，充分依据现有理论成果，创新性提出将整个CD28家族受体（CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4、BTLA）作为研究对象，研究它们在健康者与CHB患者外周总体T细胞表达状况，并分析健康人与病人之间、不同细胞之间、受体与受体之间和受体的表达与临床指标之间的差异或相关性，最终目标是系统分析CD28家族中受体在持续性HBV感染中的作用，而目前国内外均尚未见类似系统性、综合性的研究。2.首次将经典PD-1:PD-L1路径阻断方法引入到对整个CD28家族受体研究中，考察并分析阻断前后CD28家族中5个受体表达各自消长情况，受体之间的相互关系。从而分析PD-1:PD-L1阻断对CHB患者的T细胞表达CD28家族受体的影响及这些受体的表达的改变与临床指标的联系，使PD-1:PD-L1路径阻断临床研究更具客观性、具体性、整体性。3.利用胞内表达T-bet、GATA-3mRNA和IFN-γ水平联合评定PD-1:PD-L1路径阻断效果，检验耗竭的T细胞功能改善状况，且分析它们与CHB患者病毒学指标之间的关系。并根据分子生物学和免疫学基本原理进行立体分析，从理论上回答CD28家族中受体在持续HBV感染中的作用，以实现研究目标。本研究的意义本项目考虑到CD28家族成员本身的一些共性特点，将其刺激性受体和抑制性受体作为整体用于HBV持续性感染患者的分析研究中。项目一方面有望通过调查持续性HBV感染患者外周血T细胞CD28家族中的受体表达水平，以及病毒学指标相关性的分析，阐明CD28家族中受体在持续性HBV感染中的作用；另一方面是研究PD-1:PD-L1阻断对CHB患者的T细胞表达CD28家族受体及胞内细胞因子的表达的影响，并结合临床资料综合分析、立体分析单一PD-1:PD-L1路径阻断的优缺点，从而为将来临床开发和利用新的免疫学的治疗方法或新的治疗靶点提供一定的理论依据，减少CHB患者长期治疗的毒性问题，从而最终减轻患者的经济上的负担。