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目的大肠癌是临床最常见的恶性肿瘤之一。在全世界范围内,大肠癌的发病率男女均处于恶性肿瘤的第3位,其中在西方发达国家,大肠癌的发病率处于第2位。2003年美国大肠癌新发病例数和死亡病例数均居美国癌症发病数和死亡数的第3位。在我国,随着生活水平的不断提高,饮食习惯的改变,大肠癌的发病率呈上升态势。排在恶性肿瘤和致死因素的第4位。虽然大肠癌的生物学恶性行为较低手术切除后的5年生存率平均可达40%～60%,但大肠癌仍然是我国肿瘤患者死亡的主要原因之一。因此,进一步提高临床医师对大肠癌的诊治水平是十分必要的。其中,及时发现大肠癌的癌前病变、早期诊断,早期治疗以及开规范化的手术治疗是提高大肠癌疗效的关键。肿瘤相关基因的研究可能在将来为临床上大肠癌的早期诊断,术前分期,术后监测复发转移,选择化疗方案提供有意义的参考依据。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一种真核生物内源性小分子单链RNA,长18—25nt,是近年来新发现的一类非编码小RNA。miRNAs分子通过形成RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex,RISC)与靶基因3‘端非翻译区(untranslated region,UTR)不完全互补结合,诱导mRNA的切割降解,翻译抑制或者其他形式的调节机制抑制靶基因的表达。目前已发现多种miRNAs在大肠癌组织及大肠癌细胞系中异常表达,一部分在癌细胞中较正常细胞表达明显下降如miR-143、miR-145、let-7、miR-34a等,一部分表达则升高如miR-31、miR-21等。miRNAs在大肠癌的发生、发展中可能起着重要作用,寻找与大肠癌相关的miRNAs分子,阐明其作用机制,将可能丰富大肠癌的病因学和分子病理学理论。miRNAs表达谱在大肠癌细胞与正常组织细胞中存在明显差异,有研究称在大肠癌发生的腺瘤阶段即有差异,因此miRNAs在大肠癌早期诊断方面可能有重要意义。目前的研究还发现,一些化疗药物如5-Fu能改变大肠癌细胞中某些miRNAs分子表达水平,提示我们miRNAs可能作为化疗药物作用靶点,为新型抗癌药物的开发提供新的策略和思路。我们参考国内外相关文献,结合前期试验预测高度可能与大肠癌相关的miRNAs分子。应用Real-Time RT-PCR技术,针对预测得到的miRNAs分子,在大肠癌组织和对应正常大肠粘膜中进行表达水平检测,并结合术后病理资料,分析miRNAs与大肠癌临床病理因素的相关性,以其为大肠癌早期诊断和抗转移治疗提供新的线索。材料与方法试验对象是2007年11月至2009年5月份在中国医科大学第一附属医院肿瘤外科住院手术治疗的31例大肠癌患者手术切除的肿瘤组织,术中标本移出体外后立即切取一部分迅速置于液氮中冷冻后-80℃保存备用,剩余送往病理室做病理检查。全部患者均经病理证实为大肠癌,全组平均年龄60.3岁,其中男12例女19例,详细记录肿瘤临床病理学参数,同时收集距癌灶5厘米以上正常肠粘膜组织作为正常对照。本实验采用美国Ambion公司microRNA提取试剂盒,按照说明提取组织RNA,然后在RNA3’端人为地加上ploy(A)尾巴,之后进行反转录,荧光定量PCR法检测miR-18b,miR-21,miR-148b,miR-365在大肠癌组织及癌旁正常肠粘膜中表达水平。采用2-△△CT算法计算癌组织与癌旁组织中miRNAs表达量的比值,结合术后病理参数,分析microRNAs在不同病理特征大肠癌组间表达的差异。试验结果采用SPSS13.0软件进行四格表、行列资料表卡方检验或Fisher确切概率法检验,P＜0.05认为有统计学意义。试验结果一、RNA加ploy(A)尾引物延伸RT-PCR法microRNAs是长约22nt的单链小分子RNA,由于片段过短,无法设计上下游引物,因而不能用常规的PCR法检测,。因此本实验参考国内外最新文献,采用在RNA 3’端加ploy(A)尾巴,长约70-150个A(腺苷酸),然后再设计长约60nt反转录引物,引物5’端为24个T(胸腺嘧啶核苷酸)加锚定单碱基(A,C,G)。这样就将长约22nt的microRNAs反转录成为长约80nt的cDNA,再进行PCR扩增。产物经测序后证实为目的序列。我们认为此种方法是检测microRNAs的一种简单有效方法,而且费用相对较低。二、miR-18b,miR-21,miR-148b,miR-365与大肠癌临床病理因素本实验结合术后病理资料,分析了31例大肠癌的临床病理因素与4种microRNAs表达差异的关系,包括肿瘤大小、淋巴结转移有无、淋巴管癌栓有无、Duke分期、浸润深度、组织类型、生长方式等。统计学结果显示在不同浸润深度组别中,miR-18b表达水平存在明显差异,随着浸入深度增加,miR-18b表达上调比例明显增加,差异有统计学意义(P=0.03)。未发现不同病理特征组间其他3种microRNAs表达水平存在明显差异,其所有统计结果P值均大于0.05。结论1、RNA加尾引物延伸荧光定量real-time PCR法是一种简单有效的microRNAs检测方法。2、miR-18b表达上调与大肠癌浸润深度相关(P＜0.05),miR-18b高表达可能预示着大肠癌细胞浸润能力增强,恶性度增高。