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1研究背景内脏痛(Visceral pain)是一种以内脏疼痛、内脏高敏感为主要特征的常见临床表现。内脏痛不同于躯体炎性痛和神经病理痛,其疼痛位置不明确,性质难以描述,可伴有牵涉痛。内脏痛患者长期反复发作可引起继发性躯体痛敏,产生不良负面情绪,出现恶心、大量出汗、胃肠道功能紊乱等自主神经反应。内脏痛多见于胃肠道相关疾病,如肠易激综合征综合征(irritable bowel syndrome,IBS),炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)等功能性与炎症性疾病。此类疾病相当于中医肠腑病中的腹痛。目前,内脏痛相关治疗手段主要有药物治疗及手术治疗。但药物成瘾性,手术费用高昂等问题使其临床应用受限。因此,寻找更有效的替代疗法治疗内脏痛是十分必要且意义重大的。目前研究已经证实,针灸作为中医传统治疗方法,可有效缓解各种急、慢性内脏痛,其调节胃肠功能,治疗肠道类疾病临床效果较好,常用穴有天枢、足三里和上巨虚等。随着内脏痛动物模型的发展与科学技术检测手段的成熟,越来越多的学者开始从事针灸治疗内脏痛的临床及基础研究。针刺镇痛的效果可信,但对比不同穴位,不同电针强度对内脏痛反应抑制效果及其作用机制的相关研究较少。本研究采取大鼠结直肠扩张刺激(colorectal distension,CRD)诱发大鼠内脏痛。分别选取不同腧穴(足三里、天枢和曲池),不同强度的电针刺激(1 mA或3 mA)治疗结直肠扩张模型大鼠,观察比较电针对结直肠扩张大鼠腹直肌肌电的曲线下面积、频率和振幅以及结直肠扩张诱发延髓内脏带内孤束核c-fos表达的影响,探讨不同穴位、不同电针强度对结直肠扩张内脏伤害性痛反应的抑制效应,揭示不同穴位电针缓解内脏痛的作J用特点及可能机制。为针灸临床镇痛提供科研基础和理论根据。2 研究目的本实验采取结直肠扩张诱发大鼠内脏痛,以大鼠腹直肌肌电发放程度(曲线下面积、频率和振幅),c-fos阳性神经元在延髓内脏带内孤束核的表达程度为检测指标,探讨不同强度,不同穴位电针抑制大鼠内脏痛痛反应效应差异及其可能机制。3研究方法本研究选用SD大鼠54只,分别进行电生理实验(30只)和形态学实验(24只)。电生理实验中用于结,直肠扩张刺激诱导腹直肌肌电发生阈值观察的大鼠6只,剩余大鼠随机分为3组:足三里组、天枢组、和曲池组,每组8只。用于形态学研究的大鼠随机分为8组:正常组、模型组、1mA足三里组、1mA天枢组、1mA曲池组、3mA足三里组、3mA天枢组、3mA曲池组,每组3只。电生理实验中,大鼠在异氟烷(流量:1L,浓度:0.8%)麻醉状态下,采取结直肠气囊扩张诱发大鼠内脏伤害性疼痛。采用不同强度(1mA和3mA)和不同穴位(足三里、天枢、曲池)的电针干预,记录腹直肌肌电反应大鼠内脏伤害性痛的程度。同时通过免疫组化的研究方法,观察不同强度不同穴位电针刺激对结直肠扩张刺激造成孤束核c-fos阳性神经元表达增加的影响。比较在不同电针前后结直肠扩张大鼠腹直肌肌电的曲线下面积、频率、振幅以及孤束核c-fos阳性神经元表达的差异。4研究结果4.1电针对结直肠扩张刺激模型大鼠内脏伤害性痛反应电生理学实验研究4.1.1通过腹直肌肌电记录测定产生明显内脏痛现象的结直肠扩张压力的阈值给予吸入麻醉的大鼠不同压力程度(20mmHg、40mmHg、50mmHg、60mmHg、70mmHg和80mmmHg)的结直肠扩张刺激。通过对腹直肌肌电的曲线下面积、放电频率和振幅进行计算,观察到腹直肌肌电的发放逐渐增加。与扩张前相比,60mmHg、70 mmHg和80 mmHg扩张压力引起的腹直肌肌电发放明显增加,表现为腹直肌肌电曲线下面积,频率和振幅均明显增加(P<0.01)。4.1.2针刺激不同穴位对60mmHg结直肠扩张压力诱发腹直肌肌电活动抑制作用的比较1mA电针天枢穴后,腹直肌肌电的曲线下面积(24.25±14.28)mV*Sec、放电频率(19.63±6.77)Hz和振幅(23.80±6.44)mV,与电针前(42.29±6.08)mV*Sec、(34.25±4.91)Hz、(42.04±±9.12)mV相比明显减少,差异显著具有统计学意义(P<0.05)。电针1mA足三里、曲池穴后,与电针前相比,大鼠腹直肌肌电曲线下面积、放电频率和振幅无统计学差异(P>0.05)。4.1.3不同穴位3mA强度电针刺激对60mmHg结直肠扩张压力诱发腹直肌肌电活动抑制的比较3 mA电针足三里穴后,腹直肌肌电的曲线下面积(16.38±2.99)mV*Sec、放电频率(10.49±2.64)Hz和振幅(22.79±5.57)mV均,显著减少,与电针前的(43.66±9.69)mV*Sec、(31.10±3.19)Hz、、(39.98±5.47)mV相比差异有统计学意义(P<0.01)。3mA电针天枢穴后,腹直肌肌电的曲线下面积(14.47±15.65)mV*Sec、放电频率(12.41±4.58)Hz和振幅(8.63±4.28)mV均显著减少,与电针前(55.61±11.51)mV*Sec、(35.29±5.65)Hz、(44.94±6.67)mV相比差异有统计学意义(P<0.01)。3 mA电针曲池穴后,与电针前相比,大鼠腹直肌肌电曲线下面积、放电频率和振幅均无明显差异(P>0.05)。4.2电针对结直肠扩张刺激模型大鼠内脏伤害性痛反应形态学实验研究4.2.1电针对60mmHg压力结直肠扩张所致孤束核c-fos表达的影响结直肠扩张可以引起内脏感觉中枢孤束核神经元的早早基因c-fos表达。持续给予大鼠60mmHg结直肠扩张压力30分钟后,c-fos阳性神经元在孤束核区域表达数量为(58.17±4.59)个、荧光强度为(3.59±0.55)AU,均较正常组的(4.67±1.10)个、(0.54±0.12)AU显著增加(P<0.01)。4.2.2不同穴位1 mmA强度电针刺激对大鼠孤束核内c-fos神经元阳性细胞计数,平均荧光强度影响的比较在60mmHg结直肠扩张压力刺激下,1mA电针天枢穴后孤束核的c-fos阳性细胞数量为(38.33±3.97)个,荧光强度(1.37±0.16)AU,与模型组相比显著降低(PP<0.05)。1mA电针足三里和曲池穴对孤束核中c-fos阳性细胞没有明显的抑制作用(P>0.05)4.2.3不同穴位3mA强度电针刺激对大鼠孤束核内c-fos神经元阳性细胞计数,平均荧光强度影响的比较在60mmHg结直肠扩张压力刺激下,3mA电针足三里穴后孤束核的c-fos 阳性细胞数量为(36.83±5.12)个,荧光强度(1.86±0.32)AU,与模型组相比显著下降(P<0.05)。3mA电针天枢穴后孤束核的c-fos阳性细胞数量(31.50±3.62)个,荧光强度(1.40±0.27)AU,与模型组比,呈明显下降(P<0.05)。3mA电针曲池穴对孤束核中c-fos阳性细胞没有明显的抑制作用(P>0.05)。这些结果与伤害性肌电发放的结果一致。5小结1.60mmHg的结直肠扩张可诱发大鼠内脏痛,表现为腹直肌肌电的曲线下面积、频率和振幅明显增加。2.1 mA电针天枢穴,可以显著减少伤害性刺激引起的腹直肌肌电的发放并下调c-fos在延髓孤束核中的表达。3.3 mA电针足三里和天枢,可以显著减少伤害性刺激引起的腹直肌肌电的发放并下调c-fos在延髓孤束核中的表达。4.1mA和3mA电针曲池穴,对伤害性刺激引起的腹直肌肌电的发放以及c-fos在延髓孤束核中的表达均无明显作用。综上所述,电针天枢穴和足三里穴均可以显著改善伤害性刺激引起的腹直肌肌电的发放并下调c-fos在延髓孤束核中的表达,但同节段天枢穴抑制内脏痛所需的刺激量较小。