中国是世界上食管癌发病率和病死率最高的国家,每年全世界新诊断的30万食管癌患者中1/2(16.72万)以上发生在中国。食管癌的浸润转移是引起食管癌患者死亡的主要原因,因此对食管癌发生发展、浸润转移机制的探讨已成为研究的热点之一。肿瘤的发生发展是多因素、多步骤、多阶段和多基因改变的过程,癌基因和抑癌基因是受累最多的两大类型,各种关键基因的改变是人类肿瘤形成和发展的基础。近年来发现核干细胞因子(nucleostemin,NS)基因是一种新的p53结合蛋白,参与干细胞和肿瘤细胞的增殖调控,能维持细胞的扩增并抑制其向成熟细胞分化。先后发现胃癌、肾癌、乳癌、膀胱癌等肿瘤组织中NS基因表达量与肿瘤的侵袭力呈正相关,NS可能是在细胞周期的S期末和G2期通过已知的肿瘤抑制基因p53发挥作用来调节干细胞和癌细胞的增殖状态,NS可能是干细胞和肿瘤细胞穿越G2/M关键点的特异性调控因子。表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)是近年来发现的在细胞增殖和分化中起重要作用的因子,可促进正常细胞的恶性转化及刺激肿瘤细胞的增殖。还与肿瘤浸润转移密切相关。研究表明EGF是通过细胞表面的表皮生长因子受体(epidermalgrowth factor receptor,EGFR)发挥其生物学效应。在许多肿瘤组织中均发现EGF及其受体EGFR的过表达且二者具有相关性。RNA干扰(RNAi)是多种生物体内由双链RNA介导同源mRNA降解的现象。在细胞中,长的dsRNA被类似RNaseIH的Dicer酶切割成21-26核苷酸的小干扰RNA(siRNA)。RNAi基因阻断的有效性和特异性使其可能成为疾病基因疗法的理想工具。作者拟联合检测食管癌组织中NS、EGF、EGFR的表达,构建针对NS基因的siRNA真核表达载体,转染食管癌EC9706细胞株,观察EC9706细胞生物学特性的变化及NS基因沉默对裸鼠移植瘤生长的影响。全文共分3部分,摘要分述如下。第一部分食管鳞状细胞癌组织中NS、EGF及EGFR的表达及其相互关系目的探讨食管鳞状细胞癌组织中NS、EGF及EGFR的表达及三者之间的关系。方法采集62例食管鳞状细胞癌组织及其相应的31例癌旁不典型增生组织和62例正常食管黏膜组织标本。62例食管鳞状细胞癌组织学分级Ⅰ级15例,Ⅱ级25例,Ⅲ级22例;淋巴结转移20例,无淋巴结转移组42例。浸润浅层7例,肿瘤浸润深度在黏膜层、黏膜下层或浅肌层;深层55例,肿瘤浸润深度在深肌层或纤维膜。分别采用免疫组织化学、原位杂交方法检测上述标本NS、EGF、EGFR蛋白及mRNA的表达情况,RT-PCR、Real-time PCR检测NS mRNA,并分析其与食管鳞状细胞癌临床病理参数的关系。结果1)免疫组织化学方法检测结果显示:正常食管黏膜组织、癌旁不典型增生组织和食管鳞状细胞癌组织中NS蛋白阳性表达率分别为17.7%、41.9%和69.4%,3组间比较差异有统计学意义(P＜0.05);原位杂交检测结果显示:正常食管黏膜组织、癌旁不典型增生组织和食管鳞状细胞癌组织中NS mRNA阳性表达率分别为21.0%、25.8%和69.4%,3组间比较差异有统计学意义(P＜0.05);RT-PCR检测结果显示:正常食管黏膜组织、癌旁不典型增生组织和食管鳞状细胞癌组织中NS mRNA相对表达量依次为0.866±0.103、0.913±0.085、0.971±0.121,3组间比较差异有统计学意义(P＜0.05);Real-time PCR检测结果显示:食管鳞状细胞癌组织、癌旁不典型增生组织和正常食管黏膜组织中NS mRNA表达水平分别为(4.53±2.16)、(3.09±2.28)和(2.10±2.34),3组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。食管鳞状细胞癌组织中NS蛋白阳性表达率、NS mRNA阳性表达率及RT-PCR、Real-time PCR检测结果均显示:NS蛋白和NS mRNA的表达与患者的年龄、性别无关(P＞0.05);与组织学分级、浸润深度和淋巴结转移有关(P＜0.05)。组织学分级越差、浸润越深及有淋巴结转移者NS蛋白、NS mRNA阳性表达率及RT-PCR、Real-time PCR检测的NS mRNA表达水平越高。2)免疫组织化学方法检测结果显示:正常食管黏膜组织、癌旁不典型增生组织和食管鳞状细胞癌组织中EGF蛋白的阳性表达率分别为27.4%、45.2%和69.4%,3组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。原位杂交检测结果显示:正常食管黏膜组织、癌旁不典型增生组织和食管鳞状细胞癌组织中EGF mRNA的阳性表达率分别为40.3%、48.3%和77.4%。3组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。食管鳞状细胞癌组织中EGF蛋白阳性表达率、EGF mRNA阳性表达率与患者的年龄、性别无关(P＞0.05);与组织学分级、浸润深度和淋巴结转移有关(P＜0.05),组织学分级越差、浸润越深及有淋巴结转移者NS蛋白阳性表达率、EGF mRNA阳性表达率越高。3)免疫组织化学方法检测结果显示:正常食管黏膜组织、癌旁不典型增生组织和食管鳞状细胞癌组织中EGFR蛋白的阳性表达率分别为14.5%、35.5%和71.0%,3组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。原位杂交检测结果显示:正常食管黏膜组织、癌旁不典型增生组织和食管鳞状细胞癌组织中EGFR mRNA的阳性表达率分别为40.3%、48.3%和75.8%,3组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。食管鳞状细胞癌组织中EGFR蛋白阳性表达率、EGFR mRNA阳性表达率与患者的年龄、性别无关(P＞0.05);与组织学分级、浸润深度和淋巴结转移有关(P＜0.05),组织学分级越差、浸润越深及有淋巴结转移者NS蛋白、EGFR mRNA阳性表达率越高。4)食管鳞状细胞癌组织中NS蛋白和EGF、EGFR蛋白的表达呈正相关,相关系数分别为0.545、0.731;食管鳞状细胞癌组织中NS mRNA和EGF mRNA、EGFRmRNA的表达呈正相关,相关系数分别为0.394、0.604。结论NS、EGF及EGFR的表达与食管鳞状细胞癌的发生发展密切相关,并且三者之间关系密切。第二部分pRNAT-U6.1-siNS干扰表达载体的构建及其对EC9706细胞生物学特性的影响目的构建针对NS基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,筛选出抑制效率最强的表达载体,探讨NS基因siRNA表达载体转染EC9706细胞后对其细胞生物学特性的影响。方法根据GenBank提供的NS基因AY825265 mRNA序列及siRNA设计原则设计siRNA,筛选得到126-144 nt,199-217 nt和487-505 nt 3个19 bp片段为靶序列;设计包含BamHI和XhoI酶切位点的3对靶向NS发卡样DNA寡核苷酸和一对随机对照发卡样DNA寡核苷酸,经过退火,将此序列克隆至载体pRNAT-U6.1中构建重组干扰表达载体;转化感受态细菌DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆重组子。将构建好的4种siRNA表达载体转染EC9706细胞,同时设空载体对照组(转染pRNAT-U6.1空载体的细胞)及空白对照组(未转染的细胞),RT-PCR检测siRNA表达载体转染EC9706细胞后对NS mRNA的抑制作用,从而筛选出干扰效率最强的表达载体,并利用该载体转染EC9706细胞,应用Real-time PCR、原位杂交技术、Western blot和免疫细胞化学法分别检测干扰前后NS和EGFR mRNA及蛋白的表达的变化,进一步应用Boyden Chamber体外侵袭实验观察其对侵袭转移的影响,最后应用流式细胞术观察EC9706细胞周期和细胞凋亡的变化。结果1) siRNA发卡DNA的退火结果:siNS1、siNS2、siNS3和siC发卡样siRNA单链DNA寡核苷酸,退火后,电泳可见明亮条带,位于100bp下,约50-60bp处,与设计完全一致。2)克隆重组子鉴定结果:将转化菌落扩增后提取质粒,以空pRNAT-U6.1为阴性对照,使用pRNAT-U6.1插入鉴定引物进行扩增。空pRNAT-U6.1扩增产物为150 bp,阳性克隆由于插入约50 bp的发卡DNA片段,故扩增产物约为200 bp。所有3种针对NS和1个无关对照重组转化克隆都得到有阳性克隆,阳性重组子pRNAT-U6.1-siNS1、pRNAT-U6.1-siNS2、pRNAT-U6.1-siNS3和pRNAT-U6.1-siC插入片段测序的结果,与设计序列比较结果完全一致。3) RT-PCR方法分别测定各组EC9706细胞中NS mRNA表达水平显示:转染pRNAT-U6.1-siNS1、pRNAT-U6.1-siNS2和pRNAT-U6.1-siNS3的实验组细胞与3个对照组相比NS基因的mRNA表达水平明显降低,且pRNAT-U6.1-siNS2的沉默抑制作用强于pRNAT-U6.1-siNS1和pRNAT-U6.1-siNS3,几乎完全抑制,而3个对照组(无关siRNA对照组、空载体对照组和空白对照组)细胞中都存在较高水平NS mRNA表达。4)荧光定量PCR检测显示siRNA干预组NS mRNA水平为0.034±0.008;无关siRNA对照组为0.255±0.049;空白对照组为0.273±0.049;原位杂交法检测各组1000个细胞,siRNA干预组NS mRNA阳性表达细胞数20.8±22.5,无关siRNA对照组138.6±13.8,空白对照组137.6±9.9;免疫细胞化学法检测各组1000个细胞,siRNA干预组NS蛋白阳性表达细胞数60.8±33.5,无关siRNA对照组154.2±16.4,空白对照组154.0±17.2;siRNA干预组EC9706细胞NS mRNA和蛋白表达水平明显低于两个对照组(P＜0.01)。5)荧光定量PCR检测显示siRNA干预组EGFR mRNA水平为0.071±0.017;无关siRNA对照组为0.094±0.030;空白对照组为0.102±0.030;原位杂交法检测各组1000个细胞,siRNA干预组EGFR mRNA阳性表达细胞数29.4±10.4,无关siRNA对照组64.6±14.9,空白对照组79.4±20.8;免疫细胞化学法检测各组1000个细胞,siRNA干预组EGFR蛋白阳性表达细胞数38.2±15.6,无关siRNA对照组92.6±29.2,空白对照组94.8±19.4;siRNA干预组EC9706细胞EGFR mRNA和蛋白表达水平明显低于2个对照组(P＜0.01)。6) Boyden chamber体外侵袭实验结果:siRNA干预组穿越Matrigel胶的细胞数69.0±13.6,无关siRNA对照组为126.6±10.8,空白对照组119.4±20.9,与2对照组相比,siRNA干预组穿越Matrigel胶的细胞数减少(P＜0.05)。7)流式细胞术结果显示干扰NS基因的表达能明显促使细胞静止在G0/G1期,并且能诱导细胞凋亡。结论成功构建了一组针对NS基因的siRNA表达载体,并筛选出最强的干扰表达载体,NS的下调能直接影响到EGFR的表达水平的下调,此外抑制NS的表达能降低EC9706细胞侵袭转移能力,并促使细胞周期静止在G0/G1期和诱导细胞凋亡。这些数据为后续利用该基因靶向治疗食管鳞状细胞癌提供理论依据。第三部分NS基因沉默对裸鼠移植瘤生长的抑制作用目的靶向NS基因的RNAi技术沉默EC9706细胞的NS表达,探讨将其接种裸鼠体内后对EC9706细胞的生长抑制作用。方法分别将转染pRNAT-U6.1-siNS2的EC9706细胞(siRNA干预组),转染pRNAT-U6.1-siC的EC9706细胞(无关siRNA对照组)和未转染的EC9706(空白对照组)种植到裸鼠皮下,每组5只,比较裸鼠成瘤大小。分别应用RT-PCR、原位杂交、Western-blot及免疫组织化学方法检测裸鼠肿瘤组织中NS、EGF及EGFR基因mRNA和蛋白的表达情况。结果3组细胞接种裸鼠背部皮下,经过5～10 d的成瘤潜伏期后,在其接种部位形成肉眼可见的肿瘤块,5周后3组裸鼠皮下均形成瘤体,成瘤率均为100%。5周后,空白对照组移植瘤大小为(1 806.40±77.75)mm~3,无关siRNA对照组为(1702.20±88.60)mm~3,siRNA干预组为(847.00±82.25)mm~3。RT-PCR、原位杂交、Western-blot及免疫组织化学方法检测裸鼠肿瘤组织中NS基因mRNA和蛋白的表达情况均显示,siRNA干预组NS基因的mRNA及蛋白表达均较两对照组降低(P＜0.05),免疫组化和原位杂交显示siRNA干预组EGF和EGFR基因的mRNA及蛋白表达均较两对照组降低(P＜0.05)。结论EC9706细胞NS基因沉默可抑制裸鼠移植瘤生长,降低裸鼠体内NS、EGF及EGFR基因的表达。NS基因沉默可能成为食管癌治疗的新策略。