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为了研制菌丝霉素基因工程菌株,本研究利用基因工程技术,优化了假黑盘菌菌丝霉素编码基因,在此基础上构建了菌丝霉素多拷贝串联体基因并实现了其在大肠杆菌中的高效表达；通过对表达产物体外抑菌活性与溶血活性的分析,证实了菌丝霉素基因串联表达对其产物抑菌活性具有明显的改善作用。主要研究内容与结果如下：1.菌丝霉素单体基因在大肠杆菌中的表达根据假黑盘菌中菌丝霉素氨基酸序列,按照大肠杆菌密码子偏爱性,采用SOE-PCR技术,成功扩增出菌丝霉素单体基因Ple(pe),片段大小约为140bp。序列分析结果证实,扩增片段序列与野生型菌丝霉素基因序列完全一致,无突变位点。将Ple(pe)基因分别克隆到E. coli高效表达载体pGEX-4T-1和pET-30a(+)上,转化E.coli BL21(DE3)后获得了能够诱导产生Ple(pe)融合蛋白的重组菌BL21(DE3)-pGEX-Ple(pe)和BL21(DE3)-pET30a-Ple(pe),二者表达产生的融合蛋白分子量大小分别为31kDa和11kDa,前者的表达效率约为后者的6倍。将表达载体转化另一宿主菌E.coli BL21(DE3)pLysS后,重组蛋白表达效率提高了40%。2.菌丝霉素多聚体基因的构建及其在大肠杆菌中的表达以Ple(pe)基因为模版,扩增出基因两端含Xho I Sal I同尾酶酶切位点的Ple(pes-1)基因,以便构建多聚体基因。Xho I/Not I和Sal I/Not I双酶切作用下,产生含目的基因的相同粘性末端,在T4DNA连接酶作用下同向串联形成菌丝霉素基因的二、三、四、八聚体。各多聚体基因成功插入表达载体pGEX-4T-1多克隆酶切位点区。转化E.coli BL21(DE3)pLysS后,二聚体至四聚体转化子诱导产生分子量大小分别为36kDa、41kDa、46kDa的融合蛋白；与IPTG诱导2h相比,诱导4h的融合蛋白产量较高,各融合蛋白分别占其细胞总蛋白的35.7%、26.9%、12.1%。诱导4h时,四聚体融合蛋白表达效率最高,聚合度较高的八聚体转化子未检测到特异性诱导条带。选择E.coli DH5a为宿主菌,构建多聚体重组菌并检测各菌液浓度。重组菌DH-pGEX-Ple(pe)、DH-pGEX-Ple(pes-2)、DH-pGEX-Ple(pes-3)增殖受抑制作用的时间分别为诱导3h、5h、7h内,各重组菌在诱导2h时有最明显的抑菌效果；随菌丝霉素基因聚合度的增加,宿主菌的增值抑制作用得到提高,且在诱导3h时作用最明显。各重组菌融合表达产物均有较弱抑制大肠杆菌增殖生长效果,且三者的抑制作用存在一定差异,表现为随菌丝霉素基因聚合度增加,抑菌活性增加,抑菌时间延长。结果表明,菌丝霉素基因串联表达目的蛋白提高了菌内抑菌活性。3.重组菌丝霉素的分离纯化及其抗菌效果研究超声破碎处理诱导表达后的细胞,SDS-PAGE分析发现,单体转化子高达68.9%的GST-Ple(pe)融合蛋白以可溶形式表达,二聚体转化子表达的融合蛋白GST-Ple(pes-2)占细胞总蛋白的35.7%,三聚体转化子表达的融合蛋白GST-Ple(pes-3)占细胞总蛋白的26.9%。经GSTrap FF纯化各融合蛋白,纯度均达到90%以上,GST-Ple(pe)、GST-Ple(pes-2)和GST-Ple(pes-3)蛋白含量分别为1269.3μg/mL、365.5μg/mL和107.6μg/mL。纯化后融合蛋白GST-Ple(pe)、GST-Ple(pes-2)经凝血酶裂解与透析除盐处理,重组Pie(pe)与Ple(pes-2)纯度可达95%,蛋白质浓度分别为296.4μg/mL和138.5μg/mL,回收率均达到80%以上。采用微量肉汤稀释法进行重组Pie(pe)与Ple(pes-2)的最小抑菌浓度测定,发现重组菌丝霉素对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌S.aureus ATCC25923、肺炎链球菌S.pneumoniae ATCC49619、化脓性链球菌S.pyogenes ATCC19615和猪链球菌S.suis CVCC3309有强抑制作用,而对革兰氏阳性的粪链球菌E.faecalis ATCC29212和枯草芽孢杆菌B.subtilis ATCC6633无抑制作用；对革兰氏阴性的大肠杆菌E.coli ATCC25922基本没有抑制作用；对白假丝酵母菌C.albicans ATCC10231也无抑制作用。重组型与合成型菌丝霉素的体外抑菌活性效果相近,重组菌丝霉素二聚体的抑菌效果强于重组单体。重组菌丝霉素对猪红细胞无溶血活性。综上所述,本研究成功构建了菌丝霉素多拷贝串联体基因并实现了其在大肠杆菌中的高效表达；与单体基因表达产物相比,多聚表达产物的抑菌活性有明显的改善。