广西壮药黄根抗乙肝病毒活性成分筛选及作用机制研究

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目的:以HepG2.2.15细胞株为研究模型,茜草科植物黄根(Prismatomeris connata)根部具有抗乙型肝炎活性为基础,对其进行分离纯化,探讨黄根的化学成分抗乙型肝炎病毒的作用机制。方法:⒈将95%乙醇浸泡的黄根通过超声提取法,得到乙醇提取浸膏,加入适量蒸馏水分散,分别用石油醚、乙酸乙酯进行萃取分离:石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、水提取物;⒉通过MTT法测定黄根不同极性部位对HepG2.2.15细胞增殖能力的影响,酶联免疫吸附法(ELISA法)检测提取物对人肝癌细胞分泌HBeAg和HBs Ag的影响,初步筛选出活性部位;⒊利用硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析和重结晶等方法对活性部位进行分离纯化获得单体化合物,并通过FT-IR、HPLC、1H NMR、13C NMR等波谱确定化合物的结构和理化性质;⒋通过MTT法和ELISA法对分离出的化合物筛选,确定活性最好的单体化合物作为后续受试物;⒌以HepG2.2.15细胞株作为模型,采用不同浓度的受试物,拉米夫定为阳性对照,利用实时荧光定量PCR(qPCR)法,流式细胞术,Western Blot法,激光共聚焦显微镜等方法研究其抗乙肝病毒作用机制。结果:⒈从黄根中主要分离出9个化合物,大多数属于蒽醌类化合物,其中已证实4个化学结构的化合物,它们分别是:1,3-二羟基-2-甲氧基-9,10-蒽醌(A),1,3-二羟基-2-羟甲基-9,10-蒽醌(D),1,3-二羟基-2-甲基-9,10-蒽醌(甲基异茜草素)(F),蒽醌胆汁酸类偶合物(H),其中化合物H是首次从天然植物中发现,化合物D是首次从黄根中分离得到;⒉化合物A、D、F、H对细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为12.41、8.03、17.05、8.13μg/mL,药物浓度为8μg/mL时,对HBe Ag的抑制率分别为-20.95%、61.42%、43.79%、69.30%,对细胞分泌HBsAg的抑制率分别为9.42%、6.15%、23.34%、43.38%;化合物F(甲基异茜草素)活性最好。⒊共聚焦发现甲基异茜草素能够迅速进入HepG2.2.15细胞,主要分布在细胞膜、细胞质等细胞器上,下调细胞内游离钙离子浓度,WB和qPCR等实验证实可降低细胞HBV DNA含量和HBeAg水平,下调HBx蛋白的表达水平,甲基异茜草素作用后细胞被阻滞在G1期。结论:黄根中主要包含蒽醌类化合物,甲基异茜草素可能通过抑制HepG2.2.15细胞的增殖,降低乙型肝炎病毒e抗原的分泌,抑制HBx蛋白的表达等途径达到抗乙肝病毒的效果,有望成为新型的抗HBV药物。
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