随着基因工程技术的发展,蛋白表达已经成为工业生产的主要方式。甲醇型酵母巴斯德毕赤酵母(以下简称毕赤酵母)表达系统具有高表达、高分泌、高密度生长和具有翻译后修饰能力等优点,在科研和工业生产中应用十分广泛。毕赤酵母表达异源蛋白最常用的启动子是醇氧化酶基因aox1基因的启动子(简写为Paox1),该启动子在甲醇为唯一碳源条件下能够快速高效启动目的基因转录。但是毕赤酵母蛋白表达系统也存在一定的问题:一方面aaox1启动子的转录起始能力还有待进一步加强,以实现更高水平的蛋白表达;另一方面,甲醇有毒,易燃易爆,无法应用于食品和医药等领域蛋白的生产,需要添加无毒的葡萄糖和甘油等非诱导碳源。因此,aox1启动子的活性改造十分重要。此外,近几年随着合成生物学的兴起,利用合成元件在毕赤酵母中构建高效的表达系统也成为研究热点之一,这在重新编程细胞机制中发挥关键作用,使之能更好的改善人类在健康、食品、药品和能源问题的生活。本论文主要从以下三方面展开工作:一是分别构建aox1启动子的正转录调控因子Mxr1和Mit1的过表达菌株,检测过表达菌株在非诱导碳源、诱导碳源以及混合碳源下aox1启动子的转录起始能力;二是对aox1启动子序列进行改造,以egfp为报告基因,检测诱导和非诱导碳源下相关启动子元件的变化以及与正转录调控因子过表达的组合对aox1启动子活性的影响;三是在毕赤酵母中构建了一个基于人工转录因子和合成启动子的表达系统,并在酿酒酵母中进行优化设计。主要研究结果总结如下:一、分别构建过表达转录因子Mxr1和Mit1的重组菌株OEMxr1和OEMit1,发现重组菌株能够显著提升诱导碳源下aox1启动子的转录活性,并且在非诱导碳源下能部分解除aox1启动子的碳代谢阻遏。在毕赤酵母GS115中分别以组成型强启动子GAP启动子驱动Mxr1和Mit1的过表达,通过2-DG敏感性分析、氧化酶酶活和转录水平分析等手段检测过表达菌株中aox1启动子的转录能力。研究结果表明,Mxr1和Mit1的过表达均能够明显增强诱导碳源甲醇下的aox1启动子转录活性,并且能够部分解除非诱导碳源葡萄糖或甘油及其与甲醇的混合碳源下aox1启动子的碳源阻遏。二、通过突变阻遏因子Nrg1结合位点和添加正转录调控因子Mxr1和Mit1的结合基序对aox1启动子序列进行改造,改造后的aox1启动子在甲酵下的转录活性明显增强,并且与Mxr1和Mit1过表达组合后效果更佳。我们首先系统地分析了 aox1启动子上相关的顺式作用元件,对aox1启动子上的负调控因子Nrg1结合位点进行突变失活(命名为mutPaox1),对Mxr1结合位点以及假定Mit1结合位点增加拷贝数强化(命名为MBS-Paox1),以egfp为报告基因检测改造后aox1启动子的转录活性。结果表明,在毕赤酵母GS115中,在甲醇诱导条件下,MBS-Paox1转录活性较野生型有明显提高。当MBS-Paox1导入Mxr1过表达菌株中时,其在甲醇诱导条件下的转录活性进一步显著增强,报告基因表达水平是野生型启动子的3倍;与Mxr1过表达菌株不同,当MBS-Paox1导入Mit1过表达菌株则可以实现其在甘油、甘油-甲醇混合碳源下的相对高水平转录活性,相当于野生型启动子的5-8倍。为了检测改造后表达系统的实用性和有效性,我们在Mxr1或Mit1过表达菌株中使用MBS-Paox1驱动表达一个埃默森篮状菌来源的α-半乳糖苷酶,结果显示其表达水平与在野生型中相比有明显提升。三、在毕赤酵母中构建了一个基于人工转录因子和合成启动子的表达系统,并在酿酒酵母中进一步优化设计。我们以pPICZaA为出发质粒,同时表达人工锌指(zinc finger,ZF)转录因子表达盒PGAP-ZF-TT和合成启动子表达盒ZF BD-miniPaox1-yegfp-TT,转入毕赤酵母GS115。荧光分析结果表明,在人工转录因子的激活作用下,合成启动子的启动转录能力比基础转录水平高3-4倍。我们将人工转录因子和合成启动子的表达系统的组件——人工锌指转录因子ZF和合成启动子-报告基因表达盒——在酿酒酵母中进一步优化设计,并初步构建了一个人工锌指结构ZF与阻遏蛋白LacI双调控的转录调控系统。