【摘 要】
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细胞-细胞外基质（extracellular matrix,ECM）黏附是细胞辨别周围环境变化的重要途径,细胞通过细胞-基质黏附感知来自于细胞微环境的变化,特别是胞外基质的变化,进而通过胞内信号传导调整自身的形态、运动、生长、分裂、凋亡和分化等。细胞脱离细胞外基质可引起胞内信号传导的变化,进而抑制细胞增殖、激活细胞凋亡信号,并最终引起细胞“失巢凋亡”。细胞失巢凋亡是组织形成并行使正常功能的重要机制
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细胞-细胞外基质（extracellular matrix,ECM）黏附是细胞辨别周围环境变化的重要途径,细胞通过细胞-基质黏附感知来自于细胞微环境的变化,特别是胞外基质的变化,进而通过胞内信号传导调整自身的形态、运动、生长、分裂、凋亡和分化等。细胞脱离细胞外基质可引起胞内信号传导的变化,进而抑制细胞增殖、激活细胞凋亡信号,并最终引起细胞“失巢凋亡”。细胞失巢凋亡是组织形成并行使正常功能的重要机制之一,而肿瘤细胞也由于具有抗失巢凋亡的能力而变得具有很强的侵袭性。整合素（integrin）家族蛋白是细胞外基质的重要受体,在细胞与细胞外基质相互作用的过程中起着重要的连接作用。整合素受体与配体结合促进整合素的激活,其胞内结构域可以招募超过180种不同的胞内蛋白到其胞内临近细胞膜的位置,形成黏着斑（focal adhesion）。黏着斑是集结整合素-配体结合信号、诱发下游信号传导的胞内信号枢纽。ILK是整合素信号传递的关键分子,可以和parvin、PINCH形成ILK-PINCH-parvin三元复合物（简称IPP复合物）。Ras抑制蛋白1（Ras suppressor 1,RSU1）是进化上高度保守的黏着斑蛋白,通过与PINCH1结合定位于黏着斑。细胞脱离细胞外基质将引起一系列胞内信号如MEK-ERK信号通路的改变,然而相关的分子机制仍有待进一步阐明。本论文发现整合素信号关键分子RSU1的缺失增强了MEK/ERK的磷酸化水平,并且RSU1缺失后细胞的增殖也显著增加。另外,黏着斑蛋白RSU1的缺失也抑制了细胞的伸展、迁移和侵袭等细胞运动过程。本论文进一步的研究发现,RSU1参与负调节细胞脱离细胞外基质即细胞失巢时MEK-ERK信号通路的活性。当细胞失巢时,RSU1的缺失抑制了细胞失巢导致的MEK-ERK通路活性的下调。PHB2是RSU1的新的互作蛋白,PHB2定位于细胞膜的脂筏,并正调节Ras-Raf-MEK-ERK信号通路。本论文采用免疫共沉淀、pull-down、FRET等方法证明了RSU1与PHB2的相互作用,并且发现在细胞失巢时RSU1-PHB2互作增强。此外,与PHB2一样,RSU1也可以分布在细胞膜的脂筏,而且在细胞失巢时RSU1在脂筏的量有所增多,同时RSU1-PHB2的互作也增强。本论文还进一步研究了RSU1-PHB2互作,分别阐明了参与二者互作的各自的结构域。其中,PHB2的氨基酸（aa 150-206）片段与RSU1有较强的结合力,可以作为发挥显性抑制（dominant negative,DN）的片段抑制细胞内RSU1与全长PHB2互作,同时也抑制了“悬浮”条件下培养细胞的MEK/ERK磷酸化水平的下调。这说明PHB2 DN片段与RSU1缺失一样,能够抑制因细胞脱离胞外基质而引起的MEK-ERK信号通路失活,这就进一步证明了RSU1-PHB2互作在细胞失巢时调节MEK-ERK信号通路。另外,过表达不和PHB2结合的RSU1-C末端片段则不能影响细胞失巢时对MEK-ERK信号通路活性的调节。由于RSU1通过与PINCH1互作而定位于黏着斑,PINCH1也能调控MEKERK信号通路,本论文发现RSU1在PINCH1调控MEK-ERK信号通路中发挥作用。此外,本论文还利用不和PINCH1结合的RSU1-Y140K突变体验证了RSU1-PHB2信号轴对MEK-ERK通路的调节不依赖于RSU1和PINCH1的互作。综上所述,本论文提出“RSU1-PHB2”信号轴调控细胞失巢时MEK-ERK信号通路的分子机制,并进一步在3D条件培养细胞中验证了这一机制,揭示了RSU1-PHB2信号轴对体内细胞MEK-ERK信号通路的调节作用。本论文的研究全面论证了细胞-基质黏附调控MEK-ERK信号通路的“RSU1-PHB2信号轴”分子机制,完善了对整合素信号通路调控癌细胞迁移和侵袭的认识,也为探索癌症研究和治疗提供了潜在的新思路和新靶点。
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