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前列腺癌(prostate cancer,PCa)是中老年男性的常见多发病,在欧美占成年男性恶性肿瘤死亡原因的第二位;据推测在我国男性泌尿生殖系统恶性肿瘤中发病率跃居第三位。据不完全统计,每年全球有66万人被诊断出前列腺癌,大概25万死于此病。因此针对前列腺癌的相关研究具有重要意义。Hsp70-1(Heat shock protein70-1)在多种类型的肿瘤中是高表达的,并且它的高表达与肿瘤的恶性程度,发生发展,预后恢复差,转移灶的产生有着密切联系。因此,人们对于Hsp70-1的研究也越来越深入。在前列腺癌细胞中Hsp70-1的表达升高,可以帮助前列腺癌细胞部分抵抗多种抗癌药物的作用。但是目前对于Hsp70-1的研究,大部分还是停留在分子伴侣的作用上,对其下游基因的调控报道却不多。有文献报道原癌基因c-Fos在肿瘤中同样高表达,属于即刻基因,且在多种细胞应激生理活动变化中与Hsp70常常同时出现表达水平上调现象,然而Hsp70-1与c-Fos相关调节尚没有文献报道。我们前期实验中发现Hsp70-1能明显促进c-Fos表达。因此,我们运用分子生物学等方法,试图分析雄激素依赖和非依赖前列腺癌细胞中Hsp70-1对c-Fos的相关调控作用及机制。因为众所周知,Hsp70在调控AR(Androgen receptor)方面具有重要作用,我们还将进一步探讨AR在Hsp70-1调控c-Fos途径中的影响及其机理,以加深人们对Hsp70-1等信号通路在前列腺癌中发生发展机制的了解,为前列腺癌的诊断及治疗提供重要理论基础。为解决以上问题,实验内容主要分为以下几个部分:首先利用RT-PCR,Western blot等技术,检测前列腺正常细胞和癌细胞中Hsp70-1和c-Fos的表达情况。紧接着,在前期筛选的稳转细胞系LNCaP-Hsp70-1(LnD3)中,观察到Hsp70-1会上调c-Fos的表达,当加入Hsp70-1的抑制剂或者siRNA后,上述作用就会减弱甚至消失。然后在PC-3细胞中瞬时转染Hsp70-1的真核表达载体,检测过表达Hsp70-1后c-Fos及c-Fos靶基因的变化。结果显示,Hsp70-1无论在雄激素依赖或不依赖细胞中均能促进c-Fos及c-Fos靶基因的mRNA和蛋白水平的表达。接下来,在AR缺失条件下探讨Hsp70-1是如何调控c-Fos表达的。我们构建了c-Fos的报告基因质粒,采用Luciferase,Nuclear run on和Q-PCR实验技术来研究Hsp70-1对c-Fos转录水平的影响。结果发现,在PC-3细胞中过表达Hsp70-1后,c-Fos的转录活性明显升高,并且差异比较显著;相反抑制Hsp70-1的表达后,c-Fos的转录活性也随之降低。这说明Hsp70-1是在转录水平上调节c-Fos表达的。鉴于Hsp70-1对AR的重要调节作用,我们推测在雄激素依赖性前列腺癌细胞中AR很可能会影响到c-Fos的表达。为了研究AR对c-Fos的影响,我们采用前期稳转细胞系LNCaP-AR(LNA1A)细胞和后期筛选的PC-3-AR细胞。利用RT-PCR,Q-PCR,Western blot,siRNA干扰等手段来进行研究。结果发现,在雄激素依赖性LNCaP细胞中,过表达AR会上调c-Fos的表达;雄激素刺激条件下,c-Fos表达水平也上升。但在过表达Hsp70-1的LNCaP细胞中,只要敲除AR,c-Fos蛋白几乎不再表达。这说明雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP中,c-Fos表达受AR的影响。这也提示我们Hsp70-1对c-Fos的调节可能存在依赖AR和不依赖AR的两种途径。为进一步分析AR对c-Fos的影响,我们在雄激素非依赖性的PC-3细胞中过表达AR,却发现c-Fos的表达水平下降。值得注意的是PC-3和LNCaP细胞中过表达AR条件下,c-Fos变化趋势并不一致。有文献报道称HSF2(Heat shock factor 2)可以与c-Fos的启动子区域结合,所以我们在过表达AR的PC-3和LNCaP细胞中检测HSFs等的mRNA和蛋白表达水平,结果证实AR显著影响HSF1/2的表达。HSF1在两种过表达AR的细胞中mRNA变化趋势是一致的,均出现下调;而HSF2在过表达AR条件下,在雄激素依赖性细胞中出现上调,在雄激素非依赖性细胞中则下调。同样,对表达AR的雄激素非依赖性前列腺癌细胞LNCaP-AI的HSF2 mRNA分析中再一次证实AR下调HSF2。可见,HSF2受AR影响而导致的表达变化分别与不同细胞中c-Fos所受AR影响而导致的变化相一致。因此,我们推测AR是通过HSF2来调节c-Fos的。通过在前列腺癌细胞中共转AR质粒和shHSF2,证实了 AR是通过HSF2来调节c-Fos的。共转AR与HSF2启动子的荧光素酶报告基因实验也进一步证实AR在转录水平上调节HSF2表达,且AR对HSF2的调节可能不仅与AR表达水平、活性等方面相关联,还可能有更复杂的调控机制,有待我们继续探讨。综上所述,前列腺癌细胞中,Hsp70-1对c-Fos的调节存在依赖AR和不依赖AR的两种途径。AR表达条件下,AR是通过HSF2来调节c-Fos的,且其作用可能与AR表达水平、活性有关,还存在更复杂的调控机制有待进一步探讨。