神经肽Y(NeuropeptideY,NPY)是生物体内重要的神经调节因子，与个体的生长发育以及生活行为密切相关。中华倒刺鲃(SpinibarbussinensisBleeker)是我国特有的淡水鱼类之一。本实验旨在通过体外表达具有生物活性的中华倒刺鲃NPY前体，为体外研究NPY的结构与生物学功能打下基础，希望可通过将中华倒刺鲃NPY基因片段与原核表达载体pET-32a连接，转入Transetta菌中，表达具有生物活性的NPY。
　　实验1中华倒刺鲃NPY全长基因的克隆
　　仔细分析已知的中华倒刺鲃序列，设计出可克隆中华倒刺鲃NPY全长的引物。从中华倒刺鲃小脑中提取总RNA，PCR扩增双链NPY基因片段，得到的PCR产物经纯化、克隆、蓝白斑筛选后，挑取平板上白色菌落进行PCR验证，并序列测定，为克隆正确的pMD18-T/NPY重组子提供了依据。PCR扩增的中华倒刺鱼巴NPY全长片段约在750bp位置，两引物间的序列由722bp碱基组成，其中开放阅读框具有291bp碱基，前后分别有58bp和373个碱基。其中291bp的开放阅读框编码96个氨基酸，包括31个疏水性氨基酸，占氨基酸总数的32.3%。实验2中华倒刺鲃NPY基因原核表达重组子的构建
　　根据本实验室克隆的NPY全长序列，设计出克隆NPY开放阅读框序列的引物，并分别在上下游引物的5端添加酶切位点NcoI与XhoI。首先将中华倒刺鲃巴NPY的开放阅读框316bp(即NPY316)的片段克隆到E.coliDH5a菌中，同时将表达载体pET-32a转化E.coliDH5a菌。分别将两组菌进行扩大培养，提取质粒并进行双酶切。将双酶切后的目的片段与pET-32a载体连接，构建pET-32a/NPY316重组子，再转入原核表达菌株Transetta中。挑取平板上的菌落进行PCR验证、双酶切验证，以及序列测定。验证结果均表明，目的序列NPY316与pET-32a连接后成功地转化Transetta菌。测序结果显示，中华倒刺鲃NPY316基因片段并无突变。
　　实验3诱导表达中华倒刺鲃NPY前体蛋白
　　用IPTG诱导Transetta重组菌，离心收集诱导后的菌体，处理后进行SDS-PAGE电泳检测是否诱导出目的蛋白条带。最后通过WesternBlot检验判断是否表达了目的蛋白。SDS-PAGE电泳结果表明，与对照组相比，实验组约29KDa位置明显增加了一蛋白条带，经WesternBlot检验证明该蛋白即为重组Transetta菌经IPTG诱导表达的NPY前体融合蛋白。