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以三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）为研究材料，根据本实验室构建的三角帆蚌cDNA文库中已标注的EST序列,利用RACE法克隆得到两个三角帆蚌抗菌肽基因（theromacin、big defensin）的cDNA全序列，并对这2个基因的cDNA序列及推测得到的氨基酸序列特征进行分析。利用实验室克隆得到的三角帆蚌β-肌动蛋白（β-actin）基因作为内标，半定量PCR分别检测2个基因在三角帆蚌外套膜、血液、肝、肾、胃、肠、鳃、斧足8个组织的表达差异，并通过嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophilia）感染，研究这2个基因在外套膜、血液、肝脏、肠、鳃和斧足6个组织在感染后不同时间点进行实时荧光定量PCR的表达情况究。通过构建2个抗菌肽基因的原核表达载体并用IPTG作为诱导剂诱导两个基因的重组质粒在表达菌株E.coli BL21(DE3)中表达，SDS-PAGE进行初步分析。主要研究结果如下：1)三角帆蚌theromacin基因的克隆和分子结构分析该cDNA序列全长为970bp，5‘端非翻译区123bp，3‘端非翻译区526bp，开放阅读框（ORF）长为300bp，共编码99个氨基酸，包含一段由27个氨基酸组成的信号肽和72个氨基酸的成熟肽，分子量为10924.7u。氨基酸序列分析表明，该序列存在明显的跨膜结构和疏水区。同源性分析表明，该基因编码的蛋白与海兔（Aplysia californica）theromacin氨基酸序列的相似度最高为56%，而与贻贝等中发现的抗菌肽（defensins、mytilins、myticins和mytimycins）相似度较低。将所得的氨基酸序列与其他物种的不同抗菌肽的氨基酸序列进行多重序列比对，构建系统树，结果显示，本实验克隆所得三角帆蚌theromacin与已发表的几种无脊椎动物抗菌肽相聚，而不与两种贻贝的抗菌肽聚集在一起，推测此基因与这两种贻贝中发现的抗菌肽不属于同一种类型。Jpred3软件对三角帆蚌theromacin蛋白的二级结构预测结果表明，在第2-22、57-62氨基酸残基处存在α螺旋，因此，三角帆蚌的theromacin蛋白是包含跨膜螺旋的膜蛋白。以水螅（Hydra magnipapillata）Hydramacin-1A链三级结构为模板，通过ESyPred3D预测三角帆蚌theromacin蛋白的三级结构显示，此蛋白与水螅的Hydramacin-1三级结构相似。2)三角帆蚌big defensin基因的克隆和分子结构分析该cDNA序列全长为604bp，末端有典型的多聚腺苷酸信号序列AATAA和ploy（A）尾，5‘端非翻译区166bp，3‘端非翻译区96bp，开放阅读框（ORF）长为342bp，共编码113个氨基酸，包含一段由23个氨基酸组成的信号肽和90个氨基酸的成熟肽，分子量为12554.6u。氨基酸序列分析表明，该序列存在明显的跨膜结构和疏水区。同源性分析显示，该基因编码的蛋白与文昌鱼（Branchiostoma floridae）bigdefensin氨基酸序列的相似度最高为64%，而与已知的防御素（α-、β-、θ-防御素和昆虫防御素）相似度较低。与已知big defensin氨基酸序列比较发现，在成熟肽部分均有相同的保守序C-X6-C-X3-C-X13(14)-C-X4-C-C。构建系统树结果显示，本实验所得的big defensin与已知的big defensins聚在一起。Jpred3软件对该基因编码蛋白的二级结构预测结果表明，在第7-35、43-66氨基酸残基处存在α螺旋，在第41-42、95-97以及第104-108氨基酸残基处存在β折叠。由此，该基因编码的蛋白是包含跨膜螺旋的膜蛋白。以Takahide Kouno报道的日本马蹄蟹（Japanese horseshoe crab）beta-defensin三级结构(PDB id：2RNG)为模板，通过ESyPred3D预测获得了HcBD蛋白的三级结构，二者结构相似。3)半定量和荧光定量分析利用RT-PCR法以β-actin基因作为内参基因，检测theromacin和big defensin两个基因在健康三角帆蚌外套膜、血液、肝脏、胃、肠、鳃和斧足中的表达情况：theromacin基因在8个组织中均有表达，其中在三角帆蚌血液中的表达量最高，在外套膜、肝脏和鳃中微量表达，在肾、胃、肠和斧足中表达量较少。big defensin基因在8个组织中并非完全表达，仅在外套膜、血液、肝、肾、胃和肠中有表达，其中，在健康三角帆蚌外套膜、血液中的表达量相对其他组织较高，在肝、肾、胃和肠中的表达量较低，在鳃和斧足中没有检测到有big defensin基因的表达。在受嗜水气单胞菌感染后2h、4h、6h、12h、24h、48h和72h等7个时间点检测theromacin、big defensin在外套膜、血液、肝脏、肠、鳃和斧足中的表达情况。在外套膜中，theromacin、big defensin分别在4h、6h表达量最高，而二者均在12h表达量最低；在血液中，theromacin、big defensin均在72h表达量最高，分别在6h、48h表达量最低；在肝脏中，theromacin在4h表达量最高，而big defensin在48h达到峰值，二者均在24h表达量最低；在肠中，theromacin、big defensin的峰值和最低值分别是4h和24h、72h和6h；在鳃中，二者的峰值和最低值分别是4h和24h，2h和6h；在斧足中，二者均在4h达到峰值，分别在24h、12h表达量最低。4)原核表达在37℃，利用1mmol/L的IPTG诱导theromacin和big defensin基因的重组质粒在表达菌株中表达，通过SDS-PAGE进行检测显示，二者蛋白以包涵体的形式存在，表达量随诱导时间的延长而增加，二者均在6h表达量最大。结果说明，二者的重组质粒能够在诱导条件下在表达菌株E.coli BL21(DE3)中表达。