论文部分内容阅读
本实验室发现草木樨箭菌Ensifer meliloti CGMCC 7333可降解含氰基基团的烟碱类杀虫剂啶虫脒和噻虫啉,并证明腈水合酶将啶虫脒和噻虫啉代谢为相应的酰胺产物。本研究采用全基因组已测序的E.meliloti1021代谢苯甲腈(BN)、3-氰基吡啶(3-CP)和3-吲哚乙腈(IAN)三种腈化合物,进一步研究该菌株中的腈转化酶(nitrile-converting enzymes)及其生物降解和生物转化能力。高效液相色谱法(HPLC)分析显示E.meliloti 1021静息细胞降解不同浓度的BN时均会产生两个产物峰,其保留时间分别与苯甲酰胺(BAM)和苯甲酸(BAC)标准品一致;转化3-CP时会因底物浓度的不同产生不同的产物峰,以200mg/L3-CP为底物时产生两个产物峰,分别与烟酰胺(NAM)和烟酸(NAC)标准品一致,而以1g/L 3-CP作底物时仅是产生NAM一种产物;E.meliloti 1021静息转化IAN,无论底物浓度高低只能产生3-吲哚乙酰胺(IAM)。基因组分析显示E.meliloti 1021中没有腈水解酶(nitrilase)基因,存在编码腈水合酶(NHase)和酰胺酶(amidase)的基因。在E.meliloti 1021基因组中有一组显示为腈水合酶基因,一组显示为转化烟酰胺的酰胺酶基因,没有3-吲哚乙酰胺基因。在E.meliloti 1021基因组中12个酰胺酶(amidase)基因,系统发育树分析表明其中有4个酰胺酶与Genbank中的苯甲酰胺水解酶(benzamide amidohydrolase)有较高的同源性,基因克隆、表达和酶活检测结果表明只有登录号为CAC47672.1的酰胺酶具有苯转化甲酰胺的能力。克隆得到的腈水合酶核酸序列与E.meliloti CGMCC 7333的腈水合酶核酸序列相似度达97%,且同样是由三个亚基组成的。苯甲酰胺酶434个氨基酸,分子量为47 kDa,等电点为5.37,诱导表达后发现该酶的包涵体严重,后续尝试各种方式提高其可溶性。克隆得到的烟酰胺酶基因序列长636bp,蛋白分子量22.6 kDa,等电点(PI)为5.5。烟酰胺酶在30℃表达情况很好,利用Ni-柱纯化蛋白,考马斯亮蓝法测定的烟酰胺酶的蛋白浓度约为1.13mg/ml。酶学活性分析表明该酶的最适pH为7,在pH小于6和pH大于8的条件下酶活会迅速下降。对纯化后的烟酰胺酶测定相关的动力学参数,Kcat/Km为0.42 mmol/L/s,Km为 2.28mmol/L,Vmax 为 142.86 U/mg。烟酰胺酶在30-70℃之间对底物烟酰胺的活性都很高(相对酶活在97%以上)。研究发现Ag2+对烟酰胺酶抑制率最大,抑制作用达到72.2%,铁离子对该酶也有一定的抑制作用,其中Fe2+的抑制率为13.1%。有机溶剂对烟酰胺酶的活性影响较大,异戊醇对烟酰胺活性的抑制达到98.4%,三氯甲烷抑制作用到达38.1%。烟酰胺酶的底物谱很窄,只能转化烟酰胺及其结构类似物吡嗪酰胺。E.meliloti 1021静息细胞转化3-CP时发现以1g/L 3-CP为底物时没有NAC的产生,推测3-CP可能会对烟酰胺酶的转录有影响,通过定量PCR实验,以3-CP处理菌的为实验组,普通LB培养的菌体为对照组,实验结果显示对照组(相对表达量为1)和实验组(相对表达量为1.18)在转录水平差别不大,由此看来3-CP并非在烟酰胺酶基因转录水平发挥作用。利用海藻酸钠固定化烟酰胺酶,结果表明固定化的在E.coli中过表达的烟酰胺酶活性可保持活性。采用定点突变技术改变烟酰胺酶核酸序列的保守氨基酸,结果显示突变体S169T和S100T与原序列相比,在烟酰胺转化10min时,NAC产量分别提高了 1.18和1.2倍。综上所述,本文以三种典型的腈类:苯甲腈(作为污染物降解的代表)、3-CP(作为微生物转化的代表)和IAN(作为植物激素前体物质的代表)为研究对象,确认了其代谢路径是腈水合酶-酰胺酶联合作用,为草木樨剑菌代谢其他腈类提供了理论依据。