生物冶金是微生物介导的一种工艺过程，近几十年来被应用于从金属矿石及其精矿中提取某些贵金属。术语“生物冶金”包括两种不同的生物技术:生物浸出和生物氧化。生物浸出指的是将不可溶的金属矿物（一般以诸如CuS，NiS，和ZnS等硫化物形式存在）转化为可溶状态（一般以诸如CuSO4，NiSO4，ZnSO4等硫酸盐形式存在），并通过后续提取从此可溶物中分离得到所需金属（如Cu，Ni，Zn等）。生物氧化则是指将浸矿微生物应用于难溶金属（如金、银等）的预处理过程，达到在氰化物处理含有贵金属的矿石前除去其中的其他金属硫化物的目的。生物冶金的处理对象一般以两种形式存在:金属氧化物（如铀）和金属硫化物，而且就其含量而言后者更为重要。金属硫化物就其在酸中的可溶性可分为酸可溶金属硫化物和酸不可溶金属硫化物。　　目前对这两种金属硫化物的生物氧化机理的研究已获得了显著的进展，虽然在一些方面仍存在争议和未解决的问题。目前针对金属硫化矿的溶解已有研究者提出两条代谢途径:硫代硫酸盐途径（针对酸不可溶金属硫化物）和多硫化物途径（针对酸可溶金属硫化物）。上述途径中浸矿微生物主要为浸出提供铁离子（Fe3+）和氢离子(H+)。这些浸矿微生物大多是原核生物（细菌和古菌），且具有不同的生理生化特性和相互作用。根据其最适生长温度的不同，浸矿环境中的微生物主要分为三类:嗜温菌（多为革兰氏阴性细菌），中度嗜热菌（多为古菌和革兰氏阳性细菌）和嗜热菌（多为古菌）。由于金属硫化物的溶解主要依赖铁离子和氢离子，所以认为铁氧化微生物（提供铁离子）和硫氧化微生物（提供氢离子）是主要的浸矿微生物。与这些微生物存在于同一生境的还有一些异养微生物，这些嗜酸的异养微生物包括原核生物（细菌和古菌）以及真核生物（真菌）。虽然它们并不直接参与生物浸出，但由于其会对主要浸矿微生物产生正面或负面的影响，也会影响浸出效率。异养微生物在浸出系统中的一个重要的作用就是清除诸如有机酸之类的低分子量有机物，而这些有机物对嗜酸的铁氧化和硫氧化细菌具有极高的毒性。由于这些异养微生物强化和提高了对可溶性有机物(DOM)极度敏感的浸矿微生物群落的生长能力，故而异养微生物的存在有利于铁硫氧化菌的生长，从而有助于提高生物浸出效率。嗜酸异养微生物对生物浸出另一个作用是为自养浸矿微生物提供CO2和亚铁离子作为其碳源和能源。也有研究发现异养微生物可以参与生物膜（由胞外多聚物EPS和微生物组成）的形成，一般认为生物膜是金属硫化物溶解反应发生的场所。　　近几十年对微生物解离金属硫化矿机制的研究，使人们在发展和优化生物冶金技术方面得到了长足的进步。然而，生物冶金与其他生物技术一样还有许多问题有待解决，其中包括筛选更高效的微生物菌株和微生物群落并优化其在浸出过程中的生长条件。另外，因为生物冶金中的嗜酸微生物一般对有机物的耐受性很低，所以对其的分离培养也成为生物冶金研究的挑战之一。　　因此，我们提出并使用了一种新的、基于微生物相互作用的培养方法来分离和/或纯化微生物浸出菌株，并利用此方法从地理位置和环境条件差别极大的两处铜矿:谦比稀铜矿（非洲赞比亚）和德兴铜矿（亚洲中国）中分离得到了微生物菌株;然后将不同来源的两类微生物菌株分别作为土著和外来微生物对两处铜矿样品交叉进行生物浸出，并比较了其浸出效率。另外，还探究了这些微生物菌株在不同的pH，温度，重金属和有机物等环境条件下的生长特性。在施加有机酸的环境压力下，通过比较是否加入（分离到的）酵母菌时的浸出率，研究了酵母菌及其代谢产物对浸矿微生物的活性和浸出效率的影响。　　本研究的目标有:　　(1)发展一种用于快速富集、分离和纯化嗜酸铁、硫氧化细菌的高效的分离培养技术;　　(2)研究生物冶金环境中细菌与酵母菌之间可能存在的相互作用，以及此相互作用对嗜酸自养菌的生长和浸出效率的影响;　　(3)比较土著和外源微生物在生理生化和生物浸出效率方面的差异;　　为实现本研究的目的，从赞比亚的一个堆浸矿堆取样，并从中分离得到三株浸矿菌和一株酵母菌。其中，酵母菌是由单层培养基平板分离得到的。单层培养基平板是在1.5％(wt/v)琼脂糖平板中加入2.5mM连四硫酸盐和0.025％(wt/v) TSB(tryptone soya broth大豆胰蛋白胨肉汤)，之后利用其作为双层琼脂糖平板中的下层平板分离嗜酸的铁、硫氧化微生物。双层琼脂糖平板按如下所述方法制备:在浓度为1.5％(wt/v)琼脂糖溶液中加入25 mM亚铁离子，2.5mM连四硫酸盐和0.025％(wt/v) TSB，然后再加入分离得到的酵母菌(0.5-1％ v/v);把上述混合液倒入到培养基平板中形成一薄层，待其凝固后加入灭菌后的培养基用于细菌的培养。　　在纯化所分离到的培养物后，基于18S rRNA基因及基因转录间区(ITS1区、5.8S基因和ITS2)对分离到的酵母菌进行系统发育分析;基于16SrRNA和gyrB基因对分离得到的细菌进行系统发育分析。分析结果表明酵母菌为Candida digboiensis sp.，命名为NB;三株细菌分别为At.ferrooxidans FOX1, At.thiooxidans ZMB和 L.ferriphilum BN。本研究中使用的另外三株细菌是之前从德兴铜矿分离得到的，分别被命名为At.ferrooxidns YTW，At.thiooxidans A02，和 L.ferriphilumYTW315。　　然后研究了上述所有分离到的菌株在不同环境条件下的生长特性，这些条件包括温度(25-45℃);pH（1.2-3用于细菌，1.5-8用于酵母菌）;重金属如铁离子(浓度0-600 mM)和铜离子(0-70 mM)。通过在不同有机化合物（如葡萄糖，果糖，胰蛋白胨，蛋白胨，乙酸，丙酸）和无机物（硫酸亚铁，单质硫，连四硫酸盐，硫代硫酸盐，金属硫化物）中培养这些菌株以确定其碳源和能源。　　研究了酵母菌C.digboiensis对浸矿微生物生长和活性的影响。浸矿细菌用添加了硫酸亚铁(25 mM)，单质硫(1％ wt/v)，10 mM乙酸和10 mM丙酸的9K培养基进行培养。通过比较加入与不加入酵母菌C.digboiensis的培养条件下浸矿细菌的生长状况、铁氧化和硫氧化效率以及有机酸的消耗来探究酵母菌C.digboiensis对浸矿微生物生长活性的影响。　　本文还研究了酵母菌EPS（胞外多聚物）对浸矿微生物铁氧化和硫氧化效率的影响。将铁氧化和硫氧化的细菌在不含EPS和含EPS（未清除胞外多聚物）的酵母菌在9K培养基中进行混合培养，培养基中另外添加硫酸亚铁或单质硫作为能源。通过比较不同培养体系中铁氧化和硫氧化的效率以研究酵母菌胞外多聚物对不同浸矿微生物的影响。　　通过生物浸出实验探究了酵母菌与浸矿细菌之间的相互作用。实验矿样采自非洲谦比希(Chambishi)铜矿。本实验设置了3个不同浸出体系以研究酵母菌C.digboiensisNB对浸出细菌的生长、活力及浸出效率的影响:第一个体系是将浸矿细菌与酵母菌混合浸出（混合浸出体系）;第二个体系是只用浸矿细菌浸出（对照体系）;第三个体系是不加微生物的体系，仅加入与前两个体系等体积的9K培养基（非生物对照体系）。然后按照一定时间间隔测定这些体系的生物浸出参数，包括pH、Eh、微生物生长量、铁浸出率、铜浸出率和有机物含量。总之，一方面表明了异养微生物对浸矿微生物群落浸矿效率的影响，另一方面揭示了两类微生物之间的相互作用。　　然后用相似的方法以加入乙酸的黄铁矿作为浸出对象，来模拟研究酵母菌在矿浆浸出体系中的作用。因为实际浸出体系中往往含有大量的有机物（可溶有机物含量超过45％）。实验操作过程与上述实验相同，不同之处除浸出对象外还在浸出体系中加入了10 mM乙酸。　　本研究最重要的部分是比较土著与外来浸矿微生物对低品位黄铜矿的浸出。首先，拿分离自谦比稀铜矿（非洲赞比亚）和德兴铜矿（亚洲中国）的微生物作为土著细菌，分别浸出各自相应采样地的低品位黄铜矿矿样;然后，这两类细菌还作为外来浸出细菌分别用于浸出非采样地的低品位黄铜矿矿样。本实验通过分别加入这些细菌的纯培养和它们的混合培养物来揭示这些细菌在浸出体系中的作用。另外，除测定上述浸出体系的浸出参数之外，也对各浸出体系的微生物群落组成和浸出后矿渣样品组成进行了检测与分析。　　上述所有研究结果表明，分离到的酵母菌C.digboiensis NB能利用包括有机酸在内的各种有机物作为能源与碳源进行生长。酵母菌的这些特性及其对pH耐受范围(1.5-8.0)说明其能清除琼脂糖平板中的有机物，使琼脂糖平板上的嗜酸自养细菌能迅速生长。由于此酵母菌对有机物的高代谢活性，应用其同浸矿细菌进行混合培养能将浸矿菌的生长时间从2周缩短4-5数天。另外，与异养原核微生物如Acidiphilium sp.和Acidocella sp.不同，酵母菌C.digboiensisNB表现出对连四硫酸盐(tetrathionate)的高度耐受能力。　　本研究使用双层琼脂糖平板从赞比亚矿样中分离得到了3株浸出细菌，并纯化了之前从德兴分离到的3株细菌。除了对铜的耐受力之外，来自不同样点属于同一物种的菌株表现出了几乎相同的生理特性与生物浸出效率:其最适pH均低于2.0，最适生长温度在30℃至35℃之间。不仅如此，这些细菌都能通过氧化亚铁离子与硫化物分别生成铁离子和/或H+，并且它们表现出了对铁离子和铜离子的高耐受性。目前已知这两种离子是含铜硫化矿浸出体系中影响微生物生长的主要抑制因子。另外，这些细菌都不能利用有机物进行生长，但它们受有机物的影响程度有所不同。　　与所预测的一致，这些细菌均对有机酸如乙酸和丙酸非常敏感。本研究发现酵母菌C.digboiensis NB能提高上述自养细菌对有机酸的耐受能力从而使其在有机物存在时生长。结合从双层琼脂糖平板所得到的结果，强烈的暗示这两类微生物的共同生长不是偶然的，而是存在互惠关系。对加入或不加入酵母菌的浸出菌株对低品位硫化铜矿物生物浸出研究结果的比较进一步验证了该假设，在加入了酵母菌C.digboiensis NB的浸出体系中浸出率提高了8.7％。其实，酵母菌能利用自养菌产生的有机物进行生长，避免了有机物在浸出体系中的积累，从而在一定程度上促进了嗜酸铁氧化和硫氧化细菌的活力和提高了浸出效率。另外，酵母菌降解有机物形成的胞外多聚物具有一定的表面活性，能够改变硫与液体培养基之间的表面张力，最终有助于硫氧化细菌吸附在硫粒子表面。　　为了模拟酵母菌在处理含重金属污泥中的作用，本实验用酵母菌对含大量有机酸的黄铁矿进行浸出，显著提高了浸出效率。对照体系（只含有浸矿细菌的浸出体系）和混合浸出体系中铁离子浸出率在24小时后分别为6.1％和82.3％。表明酵母菌C.digboiensis与浸矿细菌混合后能成功应用于去除污泥中的重金属，以利于后续处理。　　本研究中特定的浸出菌株组合（分别分离自德兴和赞比亚）表现出了几乎一致的生理特性和浸出效率，且从赞比亚分离到的菌株在生理特性方面稍显优势。另外，从德兴分离到的菌株比从赞比亚分离到的菌株对德兴矿样的浸出效率更高，反之亦然。从赞比亚和德兴分离到的群落在浸出赞比亚矿样时浸出率分别为89％和84％。该结果表明合适的生理和生化条件是一个浸矿菌株应用于生物浸出所必需的，但这还不足以得到最高的浸出率。在一个复杂的浸出体系中，有许多因素会对浸出率产生影响，微生物的浸出潜力只是其中一个影响因素。在浸出含铜硫化矿物时，尽量使用土著微生物是提高生物浸出效率的一个较好的方案。　　综上所述，　　(1)本研究从谦比稀铜矿（非洲赞比亚）堆浸现场分离到一株酵母菌C.digboiensis NB，由于其能利用不同种类的有机物进行生长，可应用于分离和纯化浸矿微生物;　　(2)酵母菌C.digboiensis NB有助于铁氧化和硫氧化细菌在有机物压力条件下生长;　　(3)通过消除浸出体系中的有机物，避免其对浸矿微生物的毒性作用，酵母菌C.digboiensis NB能显著提高微生物的浸矿效率;　　(4)在浸出类似于含大量重金属的污泥时，酵母菌C.digboiensisNB能更显著提高浸出率（在本研究中用含有大量乙酸的黄铁矿作为对象来模拟污泥）;　　(5)酵母菌C.digboiensis NB的胞外多聚物有助于微生物菌株吸附在诸如单质硫粒子等疏水粒子表面;　　(6)最后，通过比较来源于谦比稀铜矿和德兴铜矿的微生物菌株在浸矿时的表现，表明土著微生物群落在浸出效率方面比外来微生物群落要高。在浸出含铜硫化矿物时，尽量使用土著微生物是提高生物浸出效率的一个较好的方案。