嗜虫书虱作为一种体型微小的储粮害虫,已对多种杀虫剂产生了抗药性,近些年在我国南方地区广泛爆发,严重威胁了我国粮食储藏安全。目前嗜虫书虱已广泛产生了磷化氢（Phosphine,PH3）抗性,同时随着充氮气调技术（富氮低氧）的普及和推进,嗜虫书虱可能对低氧（2%-5%O2浓度）产生适应性,进而威胁充氮气调技术的使用。目前对嗜虫书虱的低氧适应性缺乏研究基础,尤其是对已经产生PH3抗性的嗜虫书虱。本研究主要包括以下几个方面:1.不同地区嗜虫书虱的磷化氢抗性与低氧适应性分析本研究调查了书虱发生严重的华南和华中地区嗜虫书虱种群的PH3抗性和低氧适应性情况。根据FAO推荐的鉴别剂量检测发现,8个地理品系的嗜虫书虱都表现出较强的PH3抗性,未检测到敏感品系存在。在强抗鉴别剂量（0.25 mg/L熏蒸20 h）下,8个品系的平均死亡率均低于30%,最强抗性为Le ZJ品系,平均死亡率仅为8.67%。嗜虫书虱编码二氢硫辛酰胺脱氢酶（Dihydrolipoamide dehydrogenase,DLD）的DLD基因多态性分析明确了嗜虫书虱的PH3抗性与DLD的突变高度相关,在嗜虫书虱的抗性品系中,最常见的突变位点是N505H。本研究采用2%的O2浓度处理48 h对嗜虫书虱不同地理种群进行低氧的耐受性评价,PH3抗性品系Le ZJ和Le ZS具有更低的死亡率,平均死亡率仅为9.04%和12.12%,说明PH3抗性嗜虫书虱已初步表现出低氧适应性。对PH3抗性嗜虫书虱分别用亚致死剂量的PH3熏蒸和低氧处理,评估其种群适合度和生殖力参数,包括各阶段存活率、产卵量、性比和种群趋势指数等指标。结果发现,与对照组相比,低氧（1%-3%O2）对嗜虫书虱的产卵量和卵孵化率有显著的抑制作用,性比和若虫存活率无显著变化。亚致死剂量PH3熏蒸和低氧处理虽然不能完全杀死PH3抗性的嗜虫书虱,嗜虫书虱表现出一定的适合度代价,如产卵量下降。种群趋势指数分析表明PH3和低氧处理对种群具有一定的抑制作用,但抑制作用在第二代后开始减弱,进一步说明了PH3抗性嗜虫书虱具有容易发展成为低氧适应性的潜力。2.磷化氢抗性嗜虫书虱低氧适应机制的比较转录组学和代谢组学分析为揭示PH3抗性嗜虫书虱的低氧适应机制,本研究采用比较转录组学技术研究了PH3抗性嗜虫书虱在PH3熏蒸和低氧胁迫48 h后的差异表达基因（Differential expressed gene,DEG）。PH3熏蒸处理后共发现有11929个DEG,其中5520个上调,6409个下调。低氧处理后,共发现5160个DEG,其中3479个上调,1681个下调。对这些DEG进行GO富集分析发现,PH3抗性嗜虫书虱应对低氧胁迫的差异基因主要集中在营养物质代谢、核糖体和线粒体的功能等。通过KEGG富集分析发现,低氧处理上调了PH3抗性嗜虫书虱的一些重要信号通路的基因,如与类胰岛素通路相关的PI3K-Akt和MAPK信号通路以及低氧诱导因子信号通路,进而调控了营养物质代谢。此外,抗氧化酶、热激蛋白及一些与昆虫的免疫相关的信号通路也参与了嗜虫书虱应对低氧胁迫的过程。这些结果说明PH3熏蒸和低氧处理对嗜虫书虱的三大营养物质代谢和能量代谢、抗氧化酶系统和信号转导等基因的表达有显著影响。综合转录组分析结果,PH3抗性嗜虫书虱可能通过两种机制产生低氧适应性:第一是代谢重构,通过改变碳水化合物的代谢模式,增强磷酸戊糖途径和丙酮酸代谢,并补偿性地增强体内的氨基酸代谢和磷脂代谢,保证在低氧环境下的能量代谢水平,维持体内的游离氨基酸,脂肪酸和血糖的正常水平来适应低氧环境;第二是氧化损伤修复,通过增强抗氧化酶系和一系列的信号转导和免疫机制增强损伤修复,提高在低氧下的适应能力。为验证转录水平揭示的嗜虫书虱适应低氧环境的代谢调节机制,本研究利用代谢组学技术分析了PH3抗性嗜虫书虱在低氧胁迫下代谢物水平的变化。对碳水化合物、脂质、氨基酸代谢中的差异代谢物分析发现,维持血糖稳定的代谢物含量增加,游离脂肪酸和游离氨基酸的含量保持相对稳定或增加。低氧部分抑制了三羧酸循环过程,并增强了糖酵解中的丙酮酸代谢和戊糖磷酸途径。PH3抗性嗜虫书虱可通过增强体内的氨基酸代谢和磷脂代谢,保证正常的能量代谢水平,维持体内的游离氨基酸、脂肪酸和血糖的水平来适应低氧环境。3.低氧诱导因子（HIF）在嗜虫书虱低氧适应中的功能研究为进一步明确低氧诱导因子在嗜虫书虱低氧适应性中的作用,本研究克隆了嗜虫书虱HIF信号通路中3个关键的基因HIF1α、HIF1β和PHD,并研究了它们在低氧胁迫下的表达模式。HIF1α具有显著的低氧响应,而HIF1β和PHD在低氧下变化不显著。同时,本研究评估了嗜虫书虱的12个内参基因在储粮环境胁迫下的表达稳定性,筛选得到在PH3熏蒸和低氧处理过程中表达最稳定的内参基因为ACTB和EF1a,为下一步研究基因的表达和功能奠定了基础。为深入研究HIF1α在嗜虫书虱低氧适应中的作用,本研究采用饲喂ds RNA来干扰Le HIF1α,结果表明持续饲喂ds Le HIF1α2 d后Le HIF1α的转录水平显著降低。敲低Le HIF1α后,嗜虫书虱在低氧胁迫下死亡率显著上升了3.1倍,明确了HIF1α在嗜虫书虱低氧适应中的重要作用。敲低HIF1α后,其调控的下游通路中与葡萄糖代谢相关的关键调控酶基因HK,PFKL,Glut1,ALDO,ENO1和LDHA的表达量显著降低,说明HIF1信号通路通过调控下游的糖代谢相关基因调控嗜虫书虱对低氧的适应性,明确了HIF1信号通路可以调节低氧下葡萄糖的代谢模式。这些结果暗示了敲低HIF1α后扰乱了嗜虫书虱在低氧下的代谢调节机制,从而导致代谢紊乱,死亡率上升。4.抗氧化酶系在嗜虫书虱低氧适应中的作用研究抗氧化酶系在生物抵抗和适应环境胁迫中具有重要作用,转录组分析结果表明低氧和PH3可以增强嗜虫书虱的抗氧化酶系。为明确抗氧化酶系在嗜虫书虱低氧适应中的作用,本研究检测了PH3抗性嗜虫书虱经过PH3熏蒸和低氧胁迫处理后体内的活性氧水平和抗氧化酶活力的变化,发现PH3熏蒸和低氧胁迫都诱导了书虱体内的脂质过氧化,PH3熏蒸造成的氧化伤害强于低氧胁迫,同时造成了H2O2积累,而低氧胁迫无此效应。过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活力在经过低氧胁迫处理后显著增加。这些结果为探究PH3抗性嗜虫书虱在抵抗PH3熏蒸和低氧产生的氧化伤害提供了基础。本研究还克隆和鉴定了嗜虫书虱抗氧化酶系中的10个基因,并阐明了其在PH3熏蒸和低氧胁迫下的表达模式,其中SOD2、PRDX1、PRDX3和PRDX6的转录水平在低氧胁迫后显著增加,表明其在消除低氧造成的氧化损伤中起重要作用。这些结果为了解抗氧化酶系统在嗜虫书虱抵抗不利环境胁迫中的作用奠定了基础。总之,PH3抗性嗜虫书虱已成我国储粮生态中的优势种,其低氧适应性将威胁我国储粮安全。从生态学试验结果上看,PH3抗性嗜虫书虱具备发展成低氧适应性的潜力。从分子机制上看,嗜虫书虱可以通过调节代谢活动,增强氨基酸代谢,稳定体内的游离氨基酸、脂肪酸和血糖的正常水平,保证在低氧环境下的正常能量供应。同时增强HIF信号通路和抗氧化酶系统,调节能量代谢和消除氧化伤害,从而适应低氧环境。本研究结果为进一步探究嗜虫书虱PH3抗性种群的低氧适应性的分子机制提供了理论依据,并可以为制定科学有效的熏蒸和气调防治方案提供基础,为揭示储粮害虫抵抗环境胁迫的分子机制提供研究基础。