急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是威胁人类健康的常见疾病,尽管急诊冠状动脉介入和溶栓等治疗手段在一定程度上可减轻最初的心肌损伤,但无法逆转心肌梗死后大量心肌细胞坏死和损失的问题。心肌梗死后心肌细胞坏死是导致心室重构及心力衰竭的主要原因,进一步影响患者预后,因此,需要我们寻求更为理想的治疗方法以减少心肌细胞死亡或促进心肌细胞修复。许多动物模型研究表明以间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)为代表的干细胞治疗在心肌梗死治疗中显示出一定的作用,因为MSCs具有旁分泌功能及分化潜能。虽然已有研究证实MSCs治疗心肌梗死能减少心肌梗死面积、改善心功能,但也有学者提出,MSCs临床应用尚不成熟,主要表现为:MSCs分化为心肌细胞需要特殊微环境及体内外细胞因子诱导,尚无很好办法使MSCs有效分化为心肌细胞;干细胞移植存在成活率、分化率低和归巢量少等问题;安全性仍不明确,存在致瘤风险;异体移植仍然遥远;急性期药物溶栓和急诊冠状动脉介入是主要治疗手段,将MSCs移植于心脏也不符合实际,MSCs对急性期治疗效果仍不明确。因此,亟需新的治疗手段解决这些问题。MSCs具有旁分泌功能,其有益作用很大程度上是由旁分泌介导的,其中外泌体(exosomes)被认为是干细胞发挥主要作用的旁分泌因子之一。外泌体是一种由细胞通过胞吐作用分泌至胞外的膜性囊泡状小体,含有丰富的细胞因子、蛋白质、磷脂以及核糖核酸(RNA)。外泌体作为细胞之间信号传递的载体,广泛参与心血管疾病的病理和生理调节。外泌体及其所含有的微小RNA(microRNA,miRNA,miR-)在细胞间物质及信息的传递中起着非常重要的作用,尤其是从干细胞到心血管细胞传递过程中。外泌体及其miRNA也是心肌细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、血小板和炎性细胞的重要调控因子,在动脉粥样硬化的发生和发展过程中起着重要作用。外泌体还具有抗炎、抗凋亡、抗免疫增生、抗纤维化和促血管形成等有益作用。干细胞分泌的外泌体所具有的以上特性和功能为我们治疗心肌梗死提供了一种新的方法,国内外大量研究发现干细胞来源的外泌体可促进心肌梗死后心肌细胞保护、改善心功能,同时促进血管生成,外泌体所含有的miRNA在上述作用中扮演着非常重要角色,但其确切机制并不十分清楚。急性心肌梗死导致大量心肌细胞死亡,而心肌细胞坏死在心肌梗死后心室重构和心功能不全发生和发展过程中起着十分重要的作用,心肌细胞存活对心肌梗死患者预后至关重要。心肌梗死后心肌细胞死亡过程包括细胞凋亡、坏死和自噬。自噬(autophagy)是细胞内高度保守的自我消化,是一种广泛存在的正常生理过程和防御反应,对维持心肌细胞内稳态非常重要,异常的自噬可导致心脏疾病的发展。自噬与许多心脏疾病状态有关,如心肌梗死、心脏肥大、心肌病、心脏纤维化和心力衰竭。miRNA是自噬重要的调控因子之一,miRNA可通过调控某些自噬相关基因(autophagy related gene,ATG)及其调节因子影响自噬水平,在心肌梗死及心肌缺血再灌注损伤中发挥着重要作用。miRNA作用于相关靶分子抑制心肌细胞死亡,在心肌梗死后细胞纤维化、缺血性心律失常、血管重塑等病理过程中起着重要作用。在心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤中miRNA可通过促进或抑制目的基因抑制心肌细胞凋亡、缩小心肌梗死面积。miRNA-301属于miR-130/301家族,有关miRNA-301文献报道大多与肿瘤相关,在多种肿瘤性疾病中过表达,如肝癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌等,影响肿瘤发生及预后。近来发现其在心肌细胞也有表达,广泛参与调控多种生物学和病理过程,如细胞分化、炎症反应和细胞凋亡。有研究表明急性心肌梗死后梗死周围组织和心肌细胞miRNA-301表达下调,但其表达在心肌梗死中的作用以及通过外源性转染方法是否对心肌梗死起到保护作用尚不十分清楚,本研究主要探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs,BMSCs)分泌外泌体中miRNA-301对心肌梗死的保护作用及其可能机制。第一部分 miRNA-301在骨髓间充质干细胞分泌外泌体中的表达研究目的:分离大鼠骨髓间充质干细胞外泌体,将miRNA-301转染至外泌体,观察miRNA-301在骨髓间充质干细胞分泌外泌体中的表达情况,为后续研究提供实验数据。方法:提取、培养大鼠骨髓间充质干细胞,通过流式细胞技术鉴定骨髓间充质干细胞;然后分离外泌体,透射电镜下观察外泌体形态,应用Western blot检测外泌体表面蛋白标志物;骨髓间充质干细胞培养传至第3代,取融合度50%左右细胞,分为四组:空白对照组(无转染细胞)、miR-301mimics组(转染miR-301 mimics)、NM组(转染无关序列mimics)和miR-301抑制剂组(转染miR-301抑制剂),通过实时定量PCR(RT-PCR)技术检测miRNA-301的表达。结果:初次接种后,骨髓间充质干细胞悬浮于培养液中,呈大小不一的圆形,24h后部分细胞贴壁伸展,72h后可见细胞呈片状聚集,形态有梭形、多角形,第7天可见大的克隆团形成。1:2传代后细胞生长迅速,P3代以梭形细胞为主,呈极性生长,细胞形态趋于稳定。流式细胞技术鉴定细胞表面抗原CD90、CD44、CD45的阳性率分别为99.8%、99.3%、0.4%,完全符合BMSCs的基本特征标志,原代培养的BMSCs具有纯度高,均一性强的特性。透射电镜下观察到BMSCs外泌体呈圆形或椭圆形,直径约60-160nm,有完整胞膜结构,内含低密度物质。Western blot结果显示,BMSCs分泌外泌体显著表达特异性外泌体表面蛋白CD9、CD63和CD81。对照组和NM组之间miRNA-301的表达水平无明显差异(P>0.05),与对照组和NM组相比,miR-301mimics组miRNA-301的表达水平明显升高(P<0.05)。而miR-301抑制剂组低于对照组,明显低于NM组和miRNA-301mimics组(P<0.05)。结论:骨髓间充质干细胞分泌外泌体中的miRNA-301经转染后呈现高表达,为后续研究提供了良好的基础平台。第二部分 miRNA-301对大鼠心肌梗死面积及心功能影响研究目的:制作大鼠心肌梗死模型,局部注射间充质干细胞外泌体或转染miR-301和miR-301抑制剂的外泌体,4周后通过实时定量PCR(RT-PCR)技术检测各组miRNA-301的表达。应用Masson三染色评估心肌梗死面积。高分辨率超声仪测定各组大鼠左室收缩期末内径和左室舒张期末内径,计算左室射血分数和短轴缩短率,探讨miRNA-301对心肌梗死面积及心功能的影响。方法:构建大鼠心肌梗死模型,分别于梗死周边(心肌苍白和鲜红交界)区域注射磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline,PBS)、间充质干细胞外泌体、转染miR-301和miR-301抑制剂的间充质干细胞外泌体,随机分为5组:假手术组(n=6)、模型组(注射PBS,n=6)、BMSC-Exos组(注射间充质干细胞外泌体,n=6)、BMSC-miR-301-Exos组(注射转染miR-301的外泌体,n=6)和miR-301抑制剂组(注射转染miR-301抑制剂的外泌体,n=6)。4周后通过实时定量PCR(RT-PCR)技术检测各组miRNA-301的表达。心肌梗死后4周,采用10g/L戊巴比妥钠(50mg/Kg)腹腔注射麻醉大鼠,取仰卧位,使用Vevo770高分辨率动物超声影像系统,RMV704探头,频率为40 MHz,取左室乳头肌水平二维左室短轴切面,记录左室收缩期末径(left ventricular end-systolic diameter,LVESD)及左室舒张期末径(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD),由超声心动图电脑自动计算左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS),取连续3个心动周期的平均值。取心肌梗死后4周的心肌组织切片进行Masson染色评价心肌梗死面积,应用Image-Pro Plus(Media Cybernetics Inc.美国)软件分析每个心脏切片的梗死区域以及整个左心室面积。结果:心肌梗死4周后,BMSCs-Exos组和BMSC-miR-301-Exos组miRNA-301表达水平均高于模型组,BMSC-miR-301-Exos组其表达水平升高最明显,三组之间有统计学差异(P<0.05),而miR-301抑制剂组miRNA-301表达水平明显低于BMSCs-Exos组和BMSC-miR-301-Exos组,也低于模型组(P<0.05)。超声心动图结果显示,与模型组比,无论是BMSC-Exos组还是BMSC-miR-301-Exos组的LVEF、LVFS均明显升高,LVESD和LVEDD均明显下降,BMSC-miR-301-Exos组变化最显著,差异具有统计学意义(P<0.05)。与BMSC-Exos和BMSC-miR-301-Exos组比较,miR-301抑制剂组LVEF和LVFS均明显降低,LVESD和LVEDD均明显升高(P<0.05)。Masson三染色结果显示,与Model组比较,BMSC-Exos组和BMSC-miR-301-Exos组大鼠的心肌梗死面积均减少,BMSC-miR-301-Exos组最显著,并且心梗区域的瘢痕组织明显增厚,局部膨出减少(P<0.05)。miR-301抑制剂组心肌梗死面积明显高于BMSC-Exos组和BMSC-miR-301-Exos组,心肌梗死区域疤痕组织也明显减少(P<0.05)。结论:BMSCs分泌外泌体中的miRNA-301能改善大鼠心肌梗死后心功能和减少心肌梗死面积,通过外源性转染miRNA-301后BMSCs分泌的外泌体改善对心肌梗死心功能和心肌梗死面积作用更明显,为体外转染miR-301治疗心肌梗死可能提供了新的途径和方法。第三部分 BMSCs分泌外泌体中的miRNA-301通过抑制心肌自噬保护心肌梗死目的:通过透射电镜下观察假手术组、模型组、BMSC-Exos组、BMSC-miR-301-Exos组和miR-301抑制剂组大鼠心肌自噬小体变化和Western blot检测各组大鼠自噬标记蛋白LC3II/LC3I和P62水平,探讨miRNA-301抑制心肌梗死可能的机制。方法:取各组大鼠心肌梗死周边区域心肌组织,制作心肌组织切片,提取蛋白,然后应用Western blot检测各组大鼠自噬标记蛋白LC3-II/LC3-I比值和P62蛋白水平,透射电镜观察各组大鼠模型中心肌自噬小体变化。结果:与模型组比较,BMSCs-Exos组大鼠中LC3-II/LC3-I的比值降低(P<0.05),P62水平上调(P<0.05)。与BMSCs-Exos组相比,BMSCs-miR-301-Exos组大鼠中LC3-II/LC3-I的比值明显下降(P<0.05),P62水平也明显上调(P<0.05)。BMSCs-miR-301抑制剂组LC3-II/LC3-I高于模型组和BMSCs-miR-301-Exos组,而P62水平明显低于两组,组间差异均具有统计学差异(P<0.05)。透射电镜下观察各组大鼠模型中心肌自噬小体的变化,结果显示,与模型组相比,BMSCs-Exos组大鼠梗死周边区心肌组织中自噬体数量减少,与BMSCs-Exos组相比,BMSCs-miR-301-Exos组大鼠梗死周边区心肌组织中自噬体数量明显减少,而BMSCs-miR301抑制剂组自噬小体数量明显增多(P<0.05)(见Fig.B)。结论:BMSCs分泌外泌体中的miRNA-301可能通过抑制心肌自噬对心肌梗死起到保护作用。