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丝素是由蚕合成与分泌的天然蛋白质,主要由丝素和丝胶组成。具有优良的力学性能和生物相容性,目前已广泛应用于生物材料,尤其是在组织工程方面。大量研究表明,家蚕丝素能较好的支持多种细胞的粘附、增殖或分化,而对野蚕(天蚕和柞蚕)丝素的研究略少。但是野蚕丝素的氨基酸组成中分布着高度重复的RGD序列,RGD短肽也是存在于多种细胞外基质中的一种三肽,已被证明与细胞粘附性有关,具有调控细胞行为的功能。但并不是具有RGD短肽的蛋白质或多肽都具有调节细胞功能的作用,且对不同细胞的功能并不完全相同。研究发现,精氨酸被替代、甘氨酸缺失或将天冬酰胺代替天冬氨酸后都大大降低了 RGD序列的活性,说明RGD三肽侧链的完整对其活性也至关重要。为了解明含RGD的丝素蛋白是否具有特殊的调节细胞功能的作用及其影响因素,本文生物合成了来自于野蚕丝素含RGD的肽段,研究了肽段对皮肤成纤维细胞的粘附性能的影响,并重点研究了 RGD三肽侧基对细胞粘附增殖的影响。本文完成的主要工作有以下几个方面:(1)将本实验室已构建好的含RGD肽段(GSGAGG-RGD-GGYGDGSS)的编码基因的表达载体pGEX-AY4转化到大肠杆菌中诱导表达,通过GST亲和树脂纯化得到融合蛋白,经凝血酶酶切释放目的肽段(-RGD-)4。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳与质谱法鉴定表达产物,结果表明(-RGD-)4分子量与理论分子量相符,说明RGD肽段得到了正确的表达。(2)通过(-RGD-)4侧基-NH2、-COOH和-OH将其共价接枝到涤纶膜上,采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)、X射线光电子能谱(XPS)、考马斯亮蓝染色和能谱仪元素扫描(EDS)定性分析接枝情况。FTIR和XPS结果说明接枝反应后各接枝组分别形成了酯键和新的酰胺键;考马斯亮蓝染色检测发现接枝反应后涤纶膜上有(-RGD-)4肽段出现,EDS结果表明接枝反应后的涤纶膜上出现了氮元素。(3)对涤纶膜表面(-RGD-)4的接枝量、精氨酸(Arg)含量和-COOH含量进行了定量测定。(-RGD-)4-OH接枝组、-COOH接枝组和-NH2接枝组的最大接枝量分别为0.356、0.364 和 0.342mg/cm2,(-RGD-)4-OH 接枝组和-COOH 接枝组涤纶膜表面 Arg最大含量分别为0.044和0.076 mg/cm2,(-RGD-)4-NH2接枝组涤纶膜表面-COOH最大含量为0.075mmol/cm2,控制三组同一接枝量(0.342mg/cm2)时,测得用于涤纶表面接枝的-OH接枝组、-COOH接枝组和-NH2接枝组(-RGD-)4的加入量分别为0.38、0.55和 0.4 mg/cm2。(4)通过细胞计数法和CCK8试剂盒检测(-RGD-)4对皮肤成纤维细胞粘附的影响,结果显示:当(-RGD-)4直接加入培养基,浓度为0.06mM时,细胞粘附率显著提高。涤纶表面接枝(-RGD-)4肽段后能显著提高皮肤成纤维细胞的粘附性。当涤纶表面采用不同原理接枝相同量(-RGD-)4,-OH接枝组最有利于细胞的粘附,其次为-NH2接枝组,-COOH接枝组粘附率最低。-OH接枝组细胞粘附性随着接枝量的增大而增大,当接枝量在0.1mg/cm2时粘附率显著提高,0.1 5mg/cm2时粘附率达到最大。(5)通过倒置显微镜观察细胞形态和CCK8试剂盒检测(-RGD-)4对细胞增殖的影响。结果显示,(-RGD-)4对皮肤成纤维细胞的增殖活性也有一定的促进作用。当涤纶表面采用不同原理接枝相同量(-RGD-)4,-OH接枝组最有利于细胞的增殖,其次为-NH2接枝组,-COOH接枝组增殖程度最低。-OH接枝组细胞增殖性能随着接枝量的增大而提高,当接枝量在0.1 5mg/cm2时增殖程度明显提高。