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第一部分硫酸卡那霉素慢性致聋大鼠螺旋神经节细胞变性的时序性及机制研究目的：建立硫酸卡那霉素慢性致聋大鼠模型。研究硫酸卡那霉素慢性致聋大鼠螺旋神经节细胞的形态学动态变化及其退变时程,探讨内质网应激(ERS)是否参与螺旋神经节退变过程。方法：选取耳廓反射正常,听力正常的成年大鼠为研究对象,大腿内侧皮下每天注射硫酸卡那霉素500mg/kg,连续注射10天。在给药后第1,7,14,28,56,70和140天观察螺旋神经节神经元细胞形态学变化和定量分析螺旋神经节细胞密度变化,以及在给药后的各个时间点检测Bip, IRE1α, caspase-12, Phospho-eIF2-alpha (Ser51), Phospho-PERK (Thr980), GADD153和ATF-6α的表达,同时行TUNEL染色。结果：1、听功能：正常成年大鼠在4K,8K,16K,24K和32K Hz频率的ABR平均阈值分别为24.00±3.16,20.50±4.38,25.00±5.77,30.50±5.50和34.00±3.94dB SPL。在卡那霉素治疗1,7,14,28,56,70和140天后,4KHz频率ABR平均阈值分别为37.00±10.33,37.50±13.79,57.00±8.24,60.00±11.06,72.00±8.56,48.00±9.78和50.00±11.55dB SPL；8KHz频率ABR平均阈值分别为42.00±12.51,40.50±11.17,52.00±11.35,63.00±9.19,81.00±8.43,56.50±5.80和57.00±14.18dB SPL；16KHz频率ABR平均阈值分别为是59.00±11.50,58.00±11.83,64.50±6.85,67.00±11.35,83.50±5.30,66.00±12.43和61.50±19.59dB SPL；24KHz频率ABR平均阈值分别是61.50±12.26,61.00±9.66,73.50±9.14,80.50±5.99,86.00±5.68,76.50±11.80和68.50±15.64dB SPL。在32KHz频率平均阈值分别为71.50±6.69,67.50±11.37,80.50±8.96,81.00±7.75,86.50±6.26,75.50±9.56和75.00±13.33dB SPL。卡那霉素给药后,除4KHz在1和7天外,各个频率ABR平均阈值在每个时间点与正常对照组相比均有显著升高(P<0.001)。2、螺旋神经节细胞计数：对照组和实验组(给药后1,7,14,28,56,70和140天)底回SGN平均细胞密度分别为(/mm2)2334.06±169.62,2100.00±237.01,1664.47±139.45,1400.03±279.79,1334.66±85.96,1314.85±164.18,1166.43±41.69和1140.27±96.09。除卡那霉素给药后1天外,对照组和各实验组之间的SGC计数有显着性差异(P<0.001)。3、SGC超微结构变化：(I型)SGCs数量大幅减少,导致单个细胞之间的空间扩大。大部分SGCs变为树突样形状及其细胞器和细胞内容分布更加紧凑,表现出电子致密的外观。同时,核周体髓鞘变得更薄、更松弛。亚细胞水平形态结构上,在卡那霉素给药后早期,内质网扩张明显及线粒体进行性肿胀,随后从给药后28天至140天逐渐恢复。线粒体在卡那霉素给药后出现局灶性空泡化。4、TUNEL染色：在卡那霉素给药后7,14和28天,TUNEL和caspase-12染色双阳性的SGCs细胞数明显增多,并于给药后第7天,TUNEL和caspase-12染色双阳性的SGCs细胞数升高最明显。5、western blot分析：IRE1α的表达在给药后7天(P<0.05),14天(P<0.01)和56天(P<0.05)显著升高(P<0.05)。与对照组相比,BIP表达在给药后1天到56天上调(P<0.05),而在140天下调(P<0.01)。GADD153蛋白水平在给药后1天显著上调(P<0.05),持续至70天(P<0.05)并且在卡那霉素治疗后70天达到最高水平(P<0.01)。其次,在与对照组相比,P-PERK蛋白水平从给药后7天至140天上调(P<0.05),P-eIF2α蛋白水平从卡那霉素治疗后1天至56天上调(P<0.05)。第三,ATF-6a表达在对照组和实验组中几乎检测不到。最后,Caspase-12的蛋白水平在给药后1(P<0.01),7(P<0.01),14(P<0.05)和56天(P<0.01)显著上调,而在140天下调(P<0.05)结论：1、硫酸卡那霉素引起螺旋神经节细胞退变是持续性的。2、ERS参与卡那霉素所致的SGCs凋亡过程。3、部分SGCs凋亡是通过ERS引发的caspase-12和GADD153上调介导。第二部分硫酸卡那霉素慢性致聋大鼠蜗神经背侧核神经元退变时序性及其机制研究目的：硫酸卡那霉素慢性致聋大鼠后,检测蜗神经背核(DCN)梭形细胞超微结构的动态病理变化,探讨凋亡或自噬是否参与硫酸卡那霉素对DCN的神经毒性过程。方法：选取耳廓反射正常,听力正常的成年大鼠为研究对象,大腿内侧皮下每天注射硫酸卡那霉素500mg/kg,连续注射10天。给药后第1,7,14,28,56,70和140天研究成年大鼠DCN梭形细胞超微结构的动态病理变化和神经元密度变化及神经元凋亡情况；同时在给药后各个时间点检测JNK1, DAPK2, Bcl-2, p-Bcl-2, Caspase-3, LC3B和Beclin-1的表达变化。结果：1、听功能：正常成年大鼠在4K,8K,16K,24K和32K Hz频率的ABR平均阈值分别为24.00±3.16,20.50±4.38,25.00±5.77,30.50±5.50和34.00±3.94dB SPL在卡那霉素治疗1,7,14,28,56,70和140天后,4KHz频率ABR平均阈值分别为37.00±10.33,37.50±13.79,57.00±8.24,60.00±11.06,72.00±8.56,48.00±9.78和50.00±11.55dB SPL；8KHz频率ABR平均阈值分别为42.00±12.51,40.50±11.17,52.00±11.35,63.00±9.19,81.00±8.43,56.50±5.80和57.00±14.18dBS PL;16KHz频率ABR平均阈值分别为是59.00±11.50,58.00±11.83,64.50±6.85,67.00±11.35,83.50±5.30,66.00±12.43和61.50±19.59dB SPL；24KHz频率ABR平均阈值分别是61.50±12.26,61.00±9.66,73.50±9.14,80.50±5.99,86.00±5.68,76.50±11.80和68.50±15.64dB SPL。在32KHz频率平均阈值分别为71.50±6.69,67.50±11.37,80.50±8.96,81.00±7.75,86.50±6.26,75.50±9.56和75.00±13.33dB SPL。卡那霉素给药后,除4KHz在1和7天外,各个频率ABR平均阈值在每个时间点与正常对照组相比均有显著升高(P<0.001)。2、DCN梭形细胞超微结构：给药后第1天到28天梭形细胞线粒体和内质网肿胀逐渐加重,然后在给药后第28到140天逐渐恢复；线粒体局灶性空泡形成；同时,在给药后第1,7,14,28和56天自噬小体和自噬溶酶体明显增多,随后逐步恢复,最后残留为脂褐素。3、神经元密度计数和LC3阳性神经元细胞计数：给药后第1,7和14天,实验组的LC3阳性细胞数明显高于对照组,而实验组神经元细胞密度与对照组相比没有发生明显变化。4、western blot分析：首先,JNK1的表达水平在给药后第1天没有明显改变,但在第7天有显著上调(P<0.05),随后逐渐下调。第二,与对照组相比,DAPK2和caspase-3表达没有明显改变。第三,Bcl-2蛋白水平初始未发生变化,直至给药后140天出现下调(P<0.05)。p-Bcl2蛋白水平在给药后1天未发生明显上调,但于第7天的时候达到最高峰(P<0.001),并持续到给药后第28天(P<0.05)。最后,与对照组相比,Beclin-1在给药后第1天显著升高(P<0.05),在第7天达到最高峰(P<0.01),然后从给药后第14天到140天下降,但这种下降趋势并没有统计学意义。同时,LC3在第7天显著上调(P<0.01),从第14天开始到140天下降到正常水平。5、TUNEL染色：与对照组相比,任意一个实验组TUNEL阳性细胞数没有明显增高。结论：1、硫酸卡那霉素可引起DCN梭形细胞可逆性损伤。2、自噬参与了卡那霉素对DCN神经元的神经毒性过程。3、自噬的增高可能是通过JNK1-p-Bcl-2-Beclin-1信号通路调节的。