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目的探讨补肾壮筋汤抑制炎症介导骨关节炎软骨基质降解的作用机制研究方法1.选取2月龄SPF级雄性SD大鼠共45只,采用随机数字法将所选取的大鼠均分为三组,即空白组(15只)和造模组(30只),空白组行假手术(生理盐水灌胃),造模组采用改良Hulth法建立动物模型,随机数字表法分为模型组(15只,生理盐水灌胃)和补肾壮筋汤组(15只,补肾壮筋汤灌胃),灌胃1次/日,连续灌胃12周。HE染色观察关节软骨组织形态、结构的变化,通过甲苯胺蓝染色法检测关节软骨中软骨细胞数量以及蛋白多糖等相应改变,采用ELISA法检测关节滑膜组织中IL-1β、TNF-α、MMP-13的表达量。2.机械-II型胶原酶消化法,消化SPF级四周龄SD大鼠,分离出软骨细胞,LPS诱导大鼠软骨细胞体建立炎症细胞模型。体外培养的软骨细胞,分为空白组、模型组(10ng/ml LPS)、抑制剂组(10 ng/ml U0126干预30 min后加入10 ng/ml LPS)、氨基葡萄糖组(10 ng/ml LPS+1.35μg/ml氨基葡萄糖)、补肾壮筋汤组(10 ng/mlLPS+200μg/ml补肾壮筋汤),干预8 h。II型胶原免疫组织化学染色、甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞,ELISA检测培养液中IL-1β、TNF-α表达量,Western blot检测各组软骨细胞ADAMTS4、ADAMTS5、MMP-13、MMP-3、RAF 的表达,QRT-PCR 检测各组软骨细胞 ADAMTS4、ADAMTS5、MMP-13、MMP-3、RAF 的表达。结果1.HE染色显示正常关节软骨分为表层、移行层、辐射层和钙化层四层,结构清晰,排列规律,潮线清晰可见;软骨表面光滑完整,软骨细胞呈类圆形分布均匀,排列整齐;软骨下骨细胞质及细胞核染色较软骨细胞深,排列规律,分布均匀,骨小梁宽度和密度适中,模型对照组四层结构分辨不清,软骨表面粗糙,形态不规整,软骨变薄;软骨细胞分布不均匀,排列紊乱,潮线模糊,扭曲或中断;软骨下骨颜色与软骨层难以区分,发生囊变,骨小梁稀疏,补肾壮筋汤组软骨及软骨下骨的改变介于正常组和模型组之间。甲苯胺蓝染色显示正常关节软骨结构层次清晰,细胞核和软骨基质中染色明显,胞浆几乎不着色。模型组软骨基质颜色变浅,软骨层变薄,软骨细胞变少且分布不均匀,提示软骨基质中蛋白多糖减少,部分软骨细胞出现坏死。使用ELISA法测定大鼠膝关节滑膜组织中IL-1β、TNF-α、MMP-13表达量,结果显示模型组与空白组比较显著升高(P<0.05、P<0.01),补肾壮筋汤组显著低于模型组(P<0.05、P<0.01),补肾壮筋汤组与空白组之间无显著差异(P>0.05)。补肾壮筋汤组中软骨基质中蛋白多糖与软骨细胞数量明显好于模型对照组。2.经试验确定补肾壮筋汤组中补肾壮筋汤的药物浓度为200 ug/mL。ELISA检测结果显示软骨细胞上清液中IL-1β、TNF-α的表达模型组高于空白组(P<0.05、P<0.01),补肾壮筋汤组低于模型组(P<0.05、P<0.01)。软骨细胞MMP-3、MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5、RAF蛋白质含量,模型组与空白组有显著差异,模型组较空白组更高(P<0.01),但补肾壮筋汤的蛋白表达水平较模型组更低(P<0.05)。比较各组中软骨细胞MMP-3、MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5、RAF的基因表达水平,结果显示模型组表达水平较空白组更高(P<0.01),而补肾壮筋汤组的基因表达较模型组则显著降低(P<0.01)。结论1.补肾壮筋汤通过降低关节滑膜中IL-1β、TNF-α、MMP-13含量,抑制炎症介导的软骨基质降解,从而延缓骨关节炎的筋骨失养。2 补肾壮筋汤通过抑制 MMP-3、MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5、RAF 表达,抑制LPS介导的炎症反应,维持软骨细胞的功能,软骨基质稳态从而改善软骨基质的稳态失衡。