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第一部分:携带CXCR4基因的重组腺相关病毒的制备与鉴定目的:1.构建携带CXCR4基因的重组腺相关病毒载体和制备重组腺相关病毒。2.摸索聚乙烯亚胺(PEI)介导rAAV包装系统转染人胚肾293细胞(HEK293细胞)的转染条件。方法:1.RT-PCR扩增CXCR4基因后将其克隆入腺相关病毒表达质粒pAAV2.1-CMV-LacZnls,然后对构建的重组质粒pAAV2.1-CMV-CXCR4进行PCR、酶切和测序鉴定。2.用PEI介导表达绿色荧光蛋白(GFP)的rAAV包装系统(pAAV2.1-CMV-GFP,pAAV-RC2和pHelper)转染 HEK293 细胞;用ImagePro Plus6.0图像分析软件计算表达GFP的细胞比例来测定1、2、3、4、5、6 μg不同质粒剂量,1:1、3:1、5:1、7:1不同PEI/质粒比值及转染12、24、36、48、60、72h不同时间三个变量对转染效率的影响;以摸索PEI介导三质粒共转染HEK293细胞的合适条件。3.以最优的转染条件包装rAAV2-CXCR4和rAAV2-GFP,然后用PEG8000-NaCl-氯仿法纯化病毒,以SDS-PAGE法检测病毒纯度和qPCR法测定病毒滴度。结果:1.成功地构建了经PCR、酶切和测序鉴定正确的重组腺相关病毒表达质粒 pAAV2.1-CMV-CXCR4。2.质粒剂量为4 μg/孔,PEI/质粒比值为3:1-5:1时转染效率维持较高水平;转染效率-转染时间曲线为S型增长曲线,转染效率于60h达到平台期。3.纯化的rAAV2-CXCR4和rAAV2-GFP的滴度分别为2.8184X 109vg/μ1 和 3.2211×109vg/μ1。第二部分:内皮祖细胞(EPCs)的分离、培养与鉴定目的:1.分离出脐带血单个核细胞(MNCs)以将其诱导培养为EPCs。方法:1.采用密度梯度离心法从脐带血中分离MNCs后,种植在纤维连接蛋白包被的六孔板,以EGM-2培养基将其诱导分化为EPCs。培养第四天,弃去非贴细胞继续培养,每周换液2-3次。2.相差显微镜下观察内皮祖细胞的形态特征。3.流式细胞术检测EPCs的阳性标志CD34、KDR和阴性标志CD14。4.激光扫描共聚焦显微镜下观察EPCs摄取Dil-acLDL和结合FITC-UEA-1 的能力。结果:1.脐带血MNCs诱导培养第4天,全量换液后可见梭形或多角形贴壁细胞,镜下可见多个呈“血岛”样生长的细胞集落,集落中间为聚集成簇的圆形细胞,周边环绕放射状梭形细胞。培养初始2周,梭形细胞首尾相连呈条索样生长或两排细胞平行排列呈管样生长,并可见条索样或管样排列的细胞相互交错成网。培养至第3周,细胞呈现为铺路石样外观;经传代后具有次级集落形成能力。2.流式细胞术显示EPCs表面标志物CD34,KDR呈阳性,而单核、巨噬细胞系表面标志物CD14无表达。3.激光共聚焦显微镜下,EPCs胞吞Dil-ac-LDL,胞浆内可见围绕胞核呈红色荧光的内吞泡;胞膜结合FITC-UEA-1,呈现绿色荧光,并胞吞入胞浆与摄取的Dil-ac-LDL共同呈现为黄色荧光。第三部分:重组腺相关病毒介导CXCR4基因体外感染EPCs目的:1.基质细胞衍生因子1(SDF-1)及其受体CXCR4在调节EPCs定向趋化中起着至关重要的作用,因此本研究主要目的旨在探索CXCR4过表达对EPCs向SDF-1迁移的影响。2.摸索rAAV2-GFP感染EPCs的感染条件。方法:1.用ImagePro Plus6.0图像分析软件计算表达GFP的EPCs 比比例计算低感染复数(MOI10,000vg/cell)和高感染复数(100,000vg/cell)rAAV2-GFP 及其不同转染时间(12、24、48小时)的感染效率。2.以较优的感染条件将rAAV2-CXCR4、rAAV2-GFP感染EPCs后,Western Blot检测CXCR4蛋白表达水平。3.设立rAAV2-CXCR4感染组、rAAV2-GFP感染组和未感染组三组,以MTT法检测CXCR4过表达对EPCs增殖功能的影响;以transwell迁移实验检测CXCR4过表达对EPCs迁移功能的影响。结果:1.感染后12小时,低MOI(10,000vg/cell)组和高MOI(100,OOOvg/cell)组表达绿色荧光蛋白 EPCs(GFP-EPCs)比例分别为 0.2064±0.0266 和 0.3876±0.0242;感染后 24小时,GFP-EPCs比例分别增加至0.3459±0.0160和0.5941±0.0175;进一步延长感染时间,GFP-EPCs比例无进一步增加。与 MOI 为 10,000vg/cell 相比,MOI 为 100,000vg/cell时,各时间点rAAV2-GFP感染效率均较高(P<0.05)。2.rAAV2-CXCR4感染组EPCs中CXCR4蛋白的表达高于rAAV2-GFP感染组和未感染组。3.未感染组EPCs增殖呈现为S型曲线,细胞培养72小时后,融合达到增殖平台期。rAAV2-GFP感染组与rAAV2-CXCR4感染组的生长曲线相互拟合。4.Transwell迁移实验显示:在低浓度(10 ng/mL)SDF-1a和高浓度(100 ng/mL)SDF-1a情况下,与未感染组相比,rAAV2-CXCR4感染组明显增加EPCs向SDF-1a的迁移(416±33 V.S 234±16,P<0.001;504±21 V.S 413±-15,P<0.001);低浓度(10 ng/mL)SDF-1a 较高浓度(100 ng/mL)SDF-1a 增加幅度较大(181±25 V.S 91±34,P<0.001)。无论是低浓度(10 ng/mL)SDF-1a还是高浓度(100 ng/mL)SDF-1a,与未感染组相比,rAAV2-GFP均不影响EPCs向SDF-1a的迁移(218±18 V.S 234±16,P>0.05;384±16 V.S 413±15,P>0.05)。在不存在SDF-1a的情况下,各组基线EPCs迁移数量无明显差异(53±14 V.S 55±19 V.S 51±25,P>0.05)。结论:1.CXCR4过表达能增强EPCs体外靶向性迁移能力;EPCs的迁移可能依赖于SDF-1/CXCR4信号轴。2.CXCR4过表达对EPCs体外增殖无影响。