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1.异育银鲫尾鳍细胞系的建立及其对CyHV-2的敏感性研究本实验中,我们建立了异育银鲫尾鳍细胞系,命名为GiCF。原代培养的GiCF细胞形态多样,主要呈上皮样细胞和纤维样细胞的特点,稳定传代后细胞呈纤维样细胞的特点。该细胞系在20-30℃温度范围内均可生长,最适生长温度为25℃。染色体数目分布在140-166之间,有35%的中期分裂相的染色体纵数在156,3n=156为三倍体。用从患病异育银鲫肾脏和脾脏中提取的病毒悬液感染GiCF细胞,7天后细胞出现明显的病变现象,细胞收缩、变圆、脱落和细胞质空泡化;感染9天后,病变现象更加明显,出现大量的细胞脱落现象。用传至20代的CyHV-2感染细胞,细胞病变情况更加严重,感染7天后,细胞大量脱落、死亡,证明GiCF细胞对CyHV-2敏感,可用于CyHV-2的增殖。另外,CyHV-2感染GiCF细胞后出现明显的凋亡小体,TUNEL染色也能观察到明显的凋亡阳性信号,AnexinⅤ/PI染色结果表明病毒感染后发生凋亡细胞的数量显著上升。说明CyHV-2感染能引起GiCF细胞产生凋亡。2.CyHV-2感染异育银鲫m RNA转录组和小RNA转录组研究利用Illumine Hiseq 2500测序平台构建了健康组(T1K,T2K,T3K)和濒死组(T4K,T5K,T6K)异育银鲫肾脏的6个m RNA文库和6个s RNA文库。6个m RNA转录组文库中,共获得564,633,312纯净reads,经Trinity拼接一共获得了20,386条平均长度为647 bp的unigene。6个s RNA文库中,共获得9,652,774纯净reads,经比对分析得到888个成熟的miRNA,其中48个为新发现的miRNA,且这些新发现的miRNA表达量相对较低。对所有的miRNA进行差异表达分析,有23个差异表达miRNA(P<0.01),其中8个miRNA表达量显著上调,15个miRNA显著下调。用q RT-PCR实验验证显著差异表达的miRNA,表达变化趋势与测序结果基本一致。最后,对显著差异表达的miRNA进行靶基因预测,大部分miRNA有多个靶基因,一个靶基因可能受到多个miRNA共同调控,这些靶基因参与多种信号途径,如Jak-STAT信号通路、B细胞受体信号通路、凋亡和MAPK信号通路等。3.CyHV-2编码miRNA的鉴定及功能分析利用小RNA转录组数据,结合CyHV-2基因组信息,分析得到17条CyHV-2编码的miRNA,这些miRNA的前体具有良好的发卡结构。CyHV-2编码miRNA在病毒基因组上主要成簇状分布在两个区域,其中一个位于ORF42附近,包括mi R-C3,mi R-C4,和mi R-C5,另外一个区域位于ORF114附近,包括mi R-C1,mi R-C15,和mi R-C16。在CyHV-2感染过程,使用q RT-PCR检测肾脏组织中CyHV-2的拷贝数,发现感染后病毒拷贝数持续升高,感染72 h时病毒的拷贝数达到107.6copies/ml。随着CyHV-2感染的进行,PIN1和NF-κB的m RNA表达显著下降,而MHC-I,IRF3和MAPK7基因的m RNA表达显著上调。随后我们利用Stem-loop q RT-PCR检测到除了mi R-C3,mi R-C8,mi R-C16之外的14个病毒miRNA,其中mi R-C4和mi R-C5表达量最高;利用Northern blot检测8个丰度较高的miRNA时,检测到所有的8个pre-miRNA,只检测到mi R-C4和mi R-C5 2个miRNA的成熟体。利用荧光素酶报告系统证明mi R-C4能与ORF4、IRF3、RBMX和PIN1基因的3′UTR区域直接结合,而IRF3、RBMX和PIN1是RIG-I信号通路上的重要基因,我们推测CyHV-2通过编码miRNA参与调控RIG-I信号通路,从而逃避宿主的免疫反应。4.miR-C12通过下调caspase 8的表达抑制CyHV-2诱导的细胞凋亡既然CyHV-2能够诱导GiCF细胞发生凋亡,我们希望探讨CyHV-2编码的miRNA是否参与调控细胞凋亡。将8条表达丰度较高的miRNA mimics转染至GiCF细胞后,发现mi R-C10和mi R-C12抑制CyHV-2诱导的GiCF细胞凋亡,mi R-C4促进CyHV-2诱导的GiCF细胞凋亡。通过生物信息学预测及双荧光素酶报告实验,证明mi R-C12靶向抑制内源及外源表达的caspase 8基因。CyHV-2感染GiCF细胞后,caspase 8 m RNA和蛋白表达水平都显著上调,感染6 h后即可检测到mi R-C12,且表达量随着感染时间的延长而增高。然后我们分别用si RNA或Z-IETD-FHM抑制caspase 8,都能下调CyHV-2诱导的细胞凋亡。CyHV-2感染后,再转染mi R-C12 mimics将导致GiCF细胞的凋亡水平显著下调,转染mi R-C12inhibitor导致GiCF细胞凋亡水平显著上调。以上结果表明,在感染过程中,CyHV-2通过编码mi R-C12抑制细胞凋亡。为进一步探讨mi R-C12在病毒侵染过程中的调控机制,将mi R-C12 mimics,mi R-C12 inhibitor,CASP-si RNA-1和相应的对照物转染细胞,结果显示转染mi R-C12 mimics和CASP-si RNA-1均能促进CyHV-2的复制,转染mi R-C12 inhibitor抑制CyHV-2的复制。由此我们推测CyHV-2通过编码mi R-C12抑制病毒诱导的细胞凋亡,进而促进病毒在细胞内复制。