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外泌体是细胞主动分泌的一种纳米级双层膜结构的小囊泡(粒径30-150纳米),能够直接反映分泌细胞的生理和功能状态,进行细胞间的物质运输和信息通讯,不仅参与多种生理及病理过程,包括肿瘤的发生、发展及转移,而且运载丰富的、潜在的生物标志物,提供极具价值的细胞病态相关分子信息,是临床应用价值很高的液体活检标本。因此,实时监测外泌体的分泌对其发生机制、生物学功能、疾病相关性等基础和应用研究具有重要意义。目前,大多数分析方法针对细胞已释放的外泌体进行定量分析,无法获得不同外泌体的具体细胞来源。本论文针对细胞动态分泌外泌体的动态过程,以DNA四面体为基础,结合细胞膜修饰技术和荧光成像技术,设计并构建了一种简洁易操作、高稳定性的细胞膜表面DNA四面体传感器,应用于不同细胞类型分泌外泌体的实时监测。主要研究内容包括以下两方面:1、细胞膜锚定DNA四面体传感器的设计与构建DNA四面体结构具有可调控尺寸、易连接生物分子、高稳定性和低细胞毒性等优势,在分析传感与生物医学领域引起了极大的关注。为了将DNA四面体稳定地锚定于细胞膜表面,我们引入了高亲和力胆固醇疏水锚介导DNA四面体结构的锚定,设计了三种锚定策略,第一种策略是将胆固醇直接修饰在DNA四面体的三个顶点进行锚定;其他两种策略是利用胆固醇修饰的单链DNA介导DNA四面体锚定,其中,第二种是单链先与DNA四面体结合后再进行锚定,第三种是单链先锚定后再与DNA四面体结合进行锚定。结果表明前两种策略传感器在锚定过程中都会出现聚集情况,影响DNA四面体的锚定效果。而将第三种策略能够成功将DNA四面体锚定于细胞膜表面。且在细胞培养条件下,该支架结构能够较长时间停留在细胞膜表面,并显示出较高的稳定性。2、细胞膜锚定DNA四面体传感器实时监测外泌体的分泌针对外泌体膜表面蛋白CD63,我们将CD63核酸适配体序列融入到DNA四面体支架中构建DNA四面体传感器,通过特异性捕获细胞膜表面释放的外泌体,监测膜表面荧光的变化,测定外泌体的分泌情况。胆固醇修饰的单链DNA通过疏水作用锚定于细胞膜表面,且能够与DNA四面体顶点上的三个延伸脚趾结合,从而将传感器锚定于细胞膜表面。DNA四面体另一个顶点上设计一个信号检测系统,由荧光基团修饰的CD63核酸适配体序列,淬灭基团修饰的淬灭探针和封闭探针组成。通过添加引发探针将封闭探针置换,从而激活传感器。当细胞分泌外泌体时,CD63核酸适配体特异性捕获外泌体,从而释放淬灭探针,传感器上的荧光信号得以恢复,其荧光信号强度与外泌体量成正相关。因此,通过监测细胞膜表面荧光的变化,能够分析外泌体的分泌情况。