研究背景与目的鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国南方及东南亚地区高发的一种头颈部恶性肿瘤,它是一种低分化、高转移的恶性肿瘤,并且解剖位置比较隐蔽,早期症状不明显而容易被忽视,因此确诊的患者有60%以上都是中晚期病例,常伴有转移发生。对于进展期的肿瘤病人,虽然通过手术治疗并结合放化疗能缩小肿瘤体积,但却不能彻底清除肿瘤,病人最终死于肿瘤的转移或复发。因此,肿瘤治疗后的高转移及高复发已成为肿瘤临床治疗中一个亟待解决的难题。近年来,“肿瘤干细胞(cancer stem cells)”学说的提出以及其在这一领域所取得的研究进展,从一个全新的角度去认识了肿瘤。从肿瘤发生学、肿瘤转移学以及肿瘤治疗学方面对肿瘤进行了全新的诠释,提出肿瘤转移和复发的根源是肿瘤干细胞,使人们在探索彻底治愈肿瘤的道路上大大地向前迈进了一步。巢蛋白(nestin)属于第Ⅵ类中间丝蛋白,最初认为其主要表达于胚胎发育时期的神经组织,在成体中,nestin仅在一小部分组织和细胞中表达。长期以来,nestin都作为神经干细胞和前体细胞的标记,nestin名字的来源即：neural stem cell protein而近年来的研究表明,在多种类型的实体瘤及相应的细胞系中也发现了nestin的表达,并且发现nestin的表达与肿瘤的恶性分型有很大的关系。在中枢神经系统中,nestin的表达与细胞增殖之间的密切关系也已经多次被证实。有文献报道,在脑肿瘤中,CD133/nestin阳性细胞被认为是潜在的肿瘤干细胞群,但是具体的机制还不是很清楚。总的来说,nestin阳性的成体细胞代表了未分化的状态,干性或者前体细胞类型及代表了病理状态。随着nestin作为中枢神经系统肿瘤干细胞标记证据的增多,及在越来越多的实体瘤中发现nestin的表达,nestin在肿瘤中的返祖表现机制及在肿瘤干细胞中扮演了什么角色,开始引起了更多学者的关注。关于鼻咽部干细胞的研究已有一些报告,Zhang HB等在鼻咽癌细胞株5-8F的体外实验中发现了鼻咽粘膜基底部有散在干细胞,WangJ等在鼻咽癌细胞株CNE2中分离出类似干细胞的侧群细胞。然而,nestin与鼻咽癌的关系如何及是否为鼻咽癌肿瘤干细胞的重要标记物,迄今尚无相关的报道。本课题旨在研究nestin在鼻咽癌细胞株和组织中的表达特性；进一步通过改变nestin的表达水平观察其对于鼻咽癌细胞生物学特性及鼻咽癌细胞干性的影响,特别是关注nestin对鼻咽癌细胞干性的影响,探讨nestin在鼻咽癌细胞中的功能,为进一步寻找nestin基因表达调控及相关的信号通路提供参考,并为阐明鼻咽癌的发病机制和寻找新的早期诊断与分子靶向治疗靶点提供新线索。研究内容与方法1.Nestin在鼻咽癌中表达水平的检测采用Western blot、免疫荧光、免疫组化及real-time PCR方法从蛋白和mRNA水平检测nestin在4株鼻咽癌细胞5-8F、6-10B、CNE1和CNE2及鼻咽癌组织标本中的表达情况。2.构建nestin基因的shRNA表达载体及建立nestin稳定干扰的鼻咽癌细胞株构建含绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的重组靶向nestin shRNA慢病毒表达质粒,筛选阳性克隆,测序鉴定。将慢病毒载体质粒与辅助质粒共转染293T细胞包装病毒,收集病毒上清,测定滴度。经real-time PCR内源筛靶,选择最佳靶点。将重组慢病毒感染5-8F细胞,挑取单克隆,建立nestin稳定干扰的鼻咽癌细胞株。3.检测nestin表达沉默对鼻咽癌细胞5-8F细胞生物学特性的影响用MTT法检测nestin沉默后对鼻咽癌细胞体外增殖能力的影响；利用体外迁移实验(Transwell)检测nestin沉默后对鼻咽癌细胞体外迁移能力的影响；利用流式细胞术检测nestin干扰后对鼻咽癌细胞凋亡和细胞周期的影响；利用裸鼠皮下成瘤实验检测nestin干扰后对鼻咽癌细胞体内成瘤能力的影响。4.检测nestin表达沉默对鼻咽癌细胞5-8F干性的影响利用平板克隆形成实验、肿瘤球形成实验及流式细胞术分选SP细胞法检测nestin沉默后对鼻咽癌细胞干性的影响。结果1.Nestin在鼻咽癌中的表达情况利用western blot方法检测各鼻咽癌细胞株中nestin在蛋白水平的表达情况,结果表明,与永生化的鼻咽上皮细胞NP69相比,鼻咽癌细胞株中5-8F、6-10B和CNE2细胞总蛋白在大约250KD处检测到阳性杂交信号。利用免疫荧光方法检测鼻咽癌细胞株nestin的表达,结果显示,5-8F、6-10B细胞及CNE2细胞可见绿色荧光,大部分在胞质表达的,少量胞核表达的。利用real-time PCR方法检测鼻咽癌细胞株nestin的表达,结果显示鼻咽癌细胞株中5-8F和CNE2细胞中nestin有较高的表达,5-8F细胞表达最高。免疫组化法检测鼻炎癌组织、非癌鼻咽组织nestin的表达,结果显示,nestin在炎症组几乎没有阳性细胞,为阴性表达。而在低分化鳞癌和未分化癌组阳性细胞占80%左右,nestin在鼻咽癌中的表达量明显高于炎症组,并且nestin主要在胞核表达,较少在胞浆表达。2.成功构建nestin基因的shRNA表达载体及建立了nestin稳定干扰的鼻咽癌细胞株PCR和测序证实,成功构建了nestin shRNA慢病毒载体pGCL-GFP/shnestin。包装慢病毒,并测得病毒滴度为4×106TU/ml。慢病毒感染5-8F细胞,有限稀释法挑取GFP阳性克隆,real-time PCR和western blot鉴定干扰效率后建立稳定干扰nestin的鼻咽癌细胞株5-8FNESi及阴性对照细胞株5-8FNC,为进一步对nestin功能进行研究提供细胞模型。3.Nestin表达沉默后对鼻咽癌细胞5-8F细胞生物学特性的影响采用MTT法检测nestin基因沉默后细胞的体外增殖情况,对5-8F、5-8FNESiⅢ和5-8FNC三组细胞的增殖情况采用析因设计的方差分析,三组细胞的增殖能力具有显著差异(F=139.447, P<0.001),5-8FNESi细胞的增殖速度显著减慢。采用流式细胞术分析干扰nestin后5-8F、5-8FNESi和5-8FNC三组细胞的周期分布,结果发现,三组细胞的S期比例有显著差异(F=216.467,P<0.001)。5-8FNESi细胞S期细胞比例比5-8F细胞显著增加(P<0.001),也就是说,在nestin干扰后细胞出现了S期向G2/M期转化障碍,细胞被阻滞在S期。采用Traswell小室检测nestin干扰后细胞体外迁移运动能力的改变,结果发现三组细胞运动能力的差异具有显著性(F=298.278,P<0.001)。与5-8F细胞相比,5-8FNESi细胞穿过膜的细胞数显著减少(P<0.001),其运动能力明显降低。采用流式细胞术检测nestin干扰后对鼻咽癌细胞凋亡的影响,结果发现三组细胞凋亡细胞比例的差异具有显著性(F=603.612,P<0.001)。与5-8F和5-8FNC细胞相比,5-8FNESi细胞凋亡细胞比例明显升高(P=0.001)。裸鼠皮下成瘤接种后连续观察,于第21天处理5-8F组(接种5-8F细胞)、5-8FNC组(接种5-8FNC细胞)和5-8FNESi组(接种5-8FNESi细胞)各6只裸鼠。析因设计的方差分析结果表明,三组裸鼠移植瘤的体积增长有显著差异(F=14.670,P<0.001),5-8F细胞慢病毒干扰nestin后,移植瘤的体积增长明显减慢。单因素方差分析(One-way ANOVA)结果表明,三组移植瘤的平均瘤重量也有显著差异(F=19.089,P<0.001),与5-8F细胞相比,5-8FNESi细胞形成移植瘤的重量显著降低(P<0.001)。4.Nestin表达沉默后影响了鼻咽癌细胞5-8F的干性利用平板克隆形成实验、肿瘤球形成实验及流式细胞术分选SP细胞法检测nestin沉默后对鼻咽癌细胞干性的影响,统计结果采用SPSS13.0统计软件分析,结果发现,三组细胞的集落形成能力具有显著性差异(F=150.845,P<0.001),SP比例有显著差异(F=205.400,P<0.001)及肿瘤球的形成数量也有显著差异(F=830.622,P<0.001)。5-8F细胞在nestin干扰后,平板克隆集落形成率明显低于干扰前(P<0.001),SP细胞的比例明显少于干扰前(P<0.001),而5-8FNESi细胞肿瘤球的形成数量也比5-8F细胞显著减少(P<0.001)。结论1.相对于永生化的鼻咽上皮细胞NP69和鼻咽慢性炎组织,nestin在鼻咽癌细胞株和鼻咽癌组织中的表达上调。2.成功构建特异性干扰nestin的慢病毒载体pGCL-GFP/shnestin,建立稳定干扰nestin的单克隆细胞5-8FNESi及空载对照5-8FNC细胞。3.Nestin基因沉默后显著抑制了鼻咽癌细胞的体、内外增殖和迁移能力,显著增加了鼻咽癌细胞中凋亡细胞的比例,这些结果提示nestin可能是一种与鼻咽癌相关基因。4.Nestin基因沉默后显著减弱了鼻咽癌细胞5-8F的干性,表明nestin可能在维持鼻咽癌细胞干性中发挥重要作用。