铂类化合物顺铂作为临床上最常用的抗肿瘤药物之一,在睾丸癌,卵巢癌,非小细胞肺癌以及头颈部实体瘤的治疗中具有很好的疗效。但是其严重的肾毒性使其临床应用受到影响。因此探究顺铂肾毒性的机制并寻找可行的肾脏保护策略意义重大。硫氧还蛋白（TXN）系统由NADPH、硫氧还蛋白还原酶（TXNRD）、TXN组成,是生物体内重要的抗氧化系统。在哺乳动物体内,TXN系统与谷氧还蛋白系统（由NADPH、谷胱甘肽还原酶（GR）、谷胱甘肽（GSH）、谷氧还蛋白（Grx）组成）共同参与氧化还原微环境平衡的维持,并通过将电子传递给核糖核苷酸还原酶（RNR）参与DNA的复制与修复。铂类药物作为金属类的抗肿瘤药物,其铂原子能够与TXNRD中硒代半胱氨酸残基紧密结合,从而抑制硫氧还蛋白还原酶（TXNRD）的活性,同时还能够与GSH中的半胱氨酸残基结合,降低GSH的含量,使细胞内的氧化还原微环境失衡。为了探究顺铂引起的肾毒性是否与其抑制TXNRD的活性有关,我们设计了体内和体外的实验,并对比了三种铂类药对TXNRD的抑制作用和他们在体内引起的抗氧化调控的差异。其具体的研究内容包括:1、不同铂类药物在体外对TXNRD1的抑制我们首先选取了三种常用的铂类药物（即:顺铂、卡铂和奥沙利铂）,对比了它们对重组鼠野生型TXNRD1的抑制。然后通过将TXNRD1 C-末端的硒代半胱氨酸残基（Sec）突变成半胱氨酸,考察抑制反应的作用位点。结果显示三种铂类药物对TXNRD1都具有明显的抑制效果,但是顺铂的抑制效率最高,IC50为35±1.4 n M。卡铂和奥沙利铂的IC50分别为28.8±1.1μM和3.23±0.15μM,远远高于顺铂。将TXNRD1中硒代半胱氨酸残基突变成半胱氨酸残基之后,突变的TXNRD1的活性不能被铂类药物抑制,说明铂类药物的抑制作用是靶向硒代半胱氨酸残基。检测到这一反应体系中的过氧化氢产生量并无明显变化,说明铂类药物不能直接促进TXNRD1产生活性氧。同时,我们还探究了铂类药物对谷胱甘肽还原酶（GR）的抑制,发现他们并不能抑制GR的活性,进一步确定其产生抑制作用的作用位点为C-末端活性位点的Sec。2、不同铂类药物在体内抑制TXNRD及引起的细胞抗氧化调控随后,我们利用C57小鼠作为肾毒性模型小鼠,通过腹腔注射相同剂量的不同铂类药物,并分别在给药6小时和72小时后对各处理组小鼠的肾毒性进行了评价。结果显示仅顺铂处理组血清CREA和BUN含量显著上升,HE染色也显示有明显的组织损伤。然后,我们测定了不同组织中TXNRD的活性,并通过q PCR和western blot检测了相关的m RNA和蛋白表达水平。结果表明,在药物处理6小时的肾脏组织中,顺铂能够抑制TXNRD活性,抑制率达到54.25%,而奥沙利铂为27%。卡铂的抑制效果较差,为10.37%,且与对照组没有显著性差异。处理72小时后,顺铂组TXNRD活性明显上调。通过蛋白表达分析和m RNA含量的分析证明,肾脏Nrf2调控的抗氧化相关途径被激活了,促使包括TXNRD1在内的抗氧化酶的表达显著上调。此外,研究结果显示,各抗氧化酶基因的调控也具有一定的主次性,Txnrd和Homx1的m RNA水平呈现极高的上调,Nqo1和Grx1相对较低,Txnrd2、Prxs和GPxs几乎没有明显变化,说明TXNRD1在顺铂引起的肾毒性中起着至关重要的作用。3、顺铂对肾脏氧化还原微环境的影响通过研究顺铂在不同时间点对抗氧化系统的影响,我们发现顺铂能够引起肾脏氧化还原微环境的紊乱,表现为总体巯基含量先升高后降低的动态变化,以及蛋白谷胱甘肽化水平上升。通过m RNA水平的检测,我们发现Txnrd1和Homx1在给药6小时就发生了上调,而此时的TXNRD活性是受到抑制的。此后,Nqo1、Grx1也相继发生了上调。通过对Gclc、Gclm和Ggt的m RNA进行检测,我们发现GSH在顺铂肾毒性过程中也起着至关重要的作用,因为合成GSH的酶基因表达上调,而降解GSH的酶基因表达降低,但相较于Txnrd1较为滞后。Txnrd2和Txn2始终没有变化,说明线粒体基质中的氧化还原微环境没有受到明显的影响。因此TXNRD1的抑制所引起的抗氧化调控是最为迅速的,这也很可能成为顺铂引起氧化应激的首要原因。通过检测TXN1的氧化还原状态,我们发现,顺铂的处理导致了TXN1的氧化,并且尽管TXNRD活性回调也无法完全扭转TXN1的氧化,因此这有可能激活ASK1调控的凋亡途径引起细胞凋亡。4、Glrx2敲除对顺铂肾毒性的影响从上述结果可以看出,蛋白谷胱甘肽化水平的上升是顺铂引起的肾毒性中的一个显著表现。Grx系统在调控蛋白谷胱甘肽化水平中起着重要的作用,为了探究蛋白谷胱甘肽化在顺铂肾毒性中的作用,我们研究了Glrx2敲除对顺铂肾毒性的影响。研究结果表明,Glrx2敲除能够引起谷胱甘肽化水平显著上升,但是并没有加剧顺铂引起的血清CREA和BUN的含量的上升,对AST和ALT水平也没有明显影响。说明Glrx2的敲除对顺铂引起的肾毒性和肝毒性均无明显影响。通过测定肾脏TXNRD、GPx和Grx的活性以及GSH的含量,我们发现Glrx2敲除并不能改变这些抗氧化酶水平。5、硒代甲硫氨酸和亚硒酸钠可以有效减轻顺铂引起的肾毒性由于顺铂能够通过抑制TXNRD的活性引起肾脏氧化还原微环境的失衡,从而引起肾毒性,那么通过外源性的补硒,或许可以改善顺铂引起的肾毒性。因此我们通过饮水补硒的方式,预先给予相同剂量的硒代甲硫氨酸和亚硒酸钠,然后腹腔注射一定剂量的顺铂以探究补硒对顺铂肾毒性的影响。初步的研究结果表明,血清CREA和BUN水平在补硒后明显降低,而AST和ALT水平无明显变化,说明硒代甲硫氨酸和亚硒酸钠均有一定程度的减轻顺铂肾毒性的作用。HE染色结果也揭示了相同的结论。通过测定抗氧化酶活性我们发现,硒代甲硫氨酸和亚硒酸钠能够影响TXNRD和GPx的活性调控,同时能够提高GSH水平。通过分析肾脏蛋白谷胱甘肽化水平,我们发现硒代甲硫氨酸的亚硒酸钠的预处理均能够降低顺铂引起的肾脏谷胱甘肽化水平的上调。这说明,硒代甲硫氨酸和亚硒酸钠能够通过影响肾脏的氧化还原微环境改善顺铂引起的肾毒性。综上所述,我们研究结果表明:顺铂能够显著抑制TXNRD的活性,引起细胞内氧化还原微环境的失衡,并激活Nrf2抗氧化反应途径。但是体内的抗氧化体系并不能有效地逆转氧化应激,从而激活由ASK1等相关途径介导的细胞凋亡。通过使用一定剂量的硒代甲硫氨酸和亚硒酸钠预处理小鼠能够有效地预防顺铂引起的肾毒性,但是具体的作用机制有待进一步地研究。因此本课题从TXN系统出发,阐明了顺铂引起肾毒性的机制,并找到了两种可以有效减轻该毒性的药物,为治疗顺铂毒性的临床应用提供了新的思路。