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癫痫作为神经系统常见疾病之一,严重威胁着患者的身心健康,给患者及社会都带来了沉重的负担。目前在我国的900多万名癫痫患者中,25-40%左右为难治性癫痫。颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy, TLE)是最常见的难治性癫痫,传统及新型抗癫痫药物治疗效果均欠佳,手术治疗亦难得到有效控制,迄今为止TLE的发病机制尚未研究清楚。众多的证据证实氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠在行为学、神经电生理学以及海马神经元损伤的病理学改变等方面均与人类TLE相似,因此该模型是目前研究人类TLE的理想模型之一。由于急性癫痫模型只能诱发出痫性发作而非癫痫,因此慢性癫痫模型的建立对于研究癫痫发病的病理生理过程,发作间歇期的状态以及反复癫痫发作导致的长期效应是必要的。我们前期通过建立慢性癫痫模型发现,癫痫发作后线粒体功能受损,且线粒体功能的受损与线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)编码亚基mRNA表达下降及蛋白合成缺陷有关。之后我们研究了反复癫痫发作后mtDNA的氧化损伤情况,癫痫发作产生大量自由基,因mtDNA缺乏组蛋白的保护且靠近自由基生成部位,所以较之核DNA(nuclear DNA, nDNA)更易受损,mtDNA存在严重的氧化损伤,从而导致其编码功能、线粒体呼吸链功能的下降。综合我们以及其他研究者的研究,癫痫发作能造成线粒体基因组氧化损伤及超微结构受损导致其功能下降已得到广泛认可,而线粒体功能的异常是神经元损伤的重要机制之一,因此对线粒体损伤的代偿及保护机制的研究具有重要的意义。针对线粒体损伤的机体自身保护及代偿机制主要包括以下几点：一是机体的抗氧化系统,包括各种抗氧化酶以及谷胱甘肽等,能清除各种自由基,减轻氧化损伤；二是线粒体的碱基切除修复机制,通过修复损伤的mtDNA以维持线粒体基因组结构及功能的正常；三是线粒体的生物合成,通过合成新的线粒体以维持线粒体的数目及功能正常。我们之前的研究证实慢性癫痫发作后机体的抗氧化系统呈现失代偿状态,线粒体碱基切除修复机制受损。近些年来对于线粒体生物合成的研究,尤其是其在神经系统疾病中的研究日益成为热点,线粒体生物合成作为调节线粒体功能的一种有效的代偿机制,其意义重大。线粒体生物合成的过程及其调控的研究开始于上世纪70年代,虽然取得了很大的进展,但真核细胞的线粒体生物合成过程及其调控机制仍然存在很多的未知。近些年线粒体生物合成与各个系统疾病之间关系的研究成为了热点,尤其是神经系统疾病,包括帕金森病,Huntington病,脑缺血缺氧性疾病等,研究认为线粒体生物合成是一种有效的神经损伤保护代偿机制,目前对于癫痫发作后这一机制的变化尚无研究。为此,本课题建立氯化锂-匹鲁卡品大鼠癫痫模型模拟人类TLE,探讨癫痫发作后海马神经元损伤的病理组织学特征；检测慢性癫痫模型中海马线粒体生物合成的状态；检测慢性癫痫大鼠海马线粒体生物合成的调控机制,以此深入研究癫痫的发病机制并为癫痫的治疗提供可能的新靶点。本研究分三个部分：第一部分氯化锂-匹鲁卡品大鼠癫痫模型的建立及病理观察目的建立氯化锂-匹鲁卡品诱发的大鼠急、慢性癫痫模型,观察大鼠的行为学及海马组织病理学改变。方法成年雄性Wistar大鼠腹腔注射氯化锂-匹鲁卡品诱发癫痫持续状态(status epilepticus, SE), SE持续60min后腹腔注射地西泮以终止痫性发作。观察急性期大鼠的行为学改变,其后每天观察记录大鼠有无自发性痫性发作(spontaneous recurrent seizures, SRS)。于SE后3h、60d对癫痫大鼠应用Nissl染色观察海马神经元的损伤；结果1.行为学表现：根据Racine发作评分标准,痫性发作达到IV-V级发作的大鼠被认为是诱发SE成功,表现为双侧前肢的阵挛、抽搐以及全面性强直-阵挛发作,双侧后肢强直伴身体直立、躯干背曲强直、跌倒。氯化锂-匹鲁卡品模型的致痫成功率为81.3%。SE后有76%的大鼠观察到每周1-3次Ⅰ级到Ⅴ级的不同形式的SRS,表现基本同急性期,但持续时间较短暂,每次持续几秒至数十秒,很少超过1min。2.组织病理学改变：Nissl染色显示正常大鼠海马CA1区和CA3区锥体细胞排列整齐,紧密,细胞结构清晰完整,细胞核正常,染色质分布均匀,胞浆内尼氏小体丰富。急性癫痫大鼠海马的CA1和CA3区神经元丢失,排列疏松,轮廓模糊,界限不清,可见部分神经元胞体皱缩,核固缩,胞浆深染,胞浆内尼氏小体减少。慢性期大鼠海马组织病理损伤较急性期更严重,有海马萎缩表现,神经元大量脱失,其中CA3区最明显,并伴有胶质细胞增生,胶质瘢痕形成。结论根据氯化锂-匹鲁卡品腹腔注射后大鼠的行为学及组织病理学改变,说明氯化锂-匹鲁卡品可致大鼠急、慢性癫痫发作,氯化锂-匹鲁卡品致痫后可引起大鼠海马神经元损伤,与急性期相比,慢性期海马神经元损伤更为严重。第二部分氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马线粒体生物合成状态的评估目的评估氯化锂-匹鲁卡品慢性癫痫大鼠海马线粒体生物合成的状态,包括检测海马mtDNA编码蛋白质细胞色素c氧化酶第1亚基(MitochondrialCytochromecOxidaseSubunit1, COX1)及线粒体NADH脱氢酶复合物亚单位1(NADH dehydrogenase subunitl, ND1)的表达,检测mtDNA拷贝量的改变,评估线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)的复制及转录水平的改变,检测线粒体的数目及超微结构的改变。方法成年雄性Wistar大鼠随机分为慢性对照组及慢性癫痫组(SE后60d)。断头取脑迅速分离海马,提取海马组织总蛋白Western blot法检测mtDNA编码的蛋白质成分的表达；提取基因组DNA及RNA, RQ-PCR法检测mtDNA拷贝水平以及mtDNA的转录及复制水平的变化；透射电镜计数线粒体数目的改变及线粒体超微结构的损伤。结果1) mtDNA编码的蛋白质成分的表达与慢性对照组相比,慢性癫痫组海马线粒体蛋白COX1, ND1的表达明显降低(P<0.05)。2)与慢性对照组相比,慢性癫痫组海马ntDNA拷贝数明显降低(p<0.05)。3)与慢性对照组相比,慢性癫痫组海马mtDNA的转录及复制水平下降(P<0.05)。4)与慢性对照组相比,慢性癫痫组海马组织线粒体数目无明显变化(P>0.05),但慢性癫痫组海马组织线粒体的结构损伤与对照组相比具有统计学差异(p<0.05)。结论氯化锂-匹鲁卡品所致的大鼠慢性癫痫模型中,线粒体基因组编码的蛋白质表达水平,如COX1, ND1的表达水平明显降低,mtDNA拷贝量明显下降,这可能与慢性癫痫组大鼠海马mtDNA复制及转录机制受损有关。透射电镜观察线粒体的数目无明显变化,但是与对照组相比,线粒体超微结构存在不同程度的损伤。以上研究均提示反复痫性发作可致海马线粒体生物合成呈现抑制状态,可能是癫痫发作后神经元损伤及线粒体功能异常的重要机制。第三部分氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马线粒体生物合成调控机制的研究目的评估氯化锂-匹鲁卡品大鼠慢性癫痫模型中海马线粒体生物合成调控通路中各个关键因子在基因和蛋白水平表达的改变,评估线粒体转录因子的活性,从而进一步探讨慢性癫痫线粒体生物合成呈现抑制状态的分子生物学机制。方法成年雄性Wistar大鼠随机分为慢性对照组及慢性癫痫组(SE后60d)。断头取脑,迅速分离海马,分别提取基因组RNA及海马组织总蛋白及线粒体蛋白。RQ-PCR及Western blot法检测关键调控因子过氧化物酶体增殖物激活受体Y辅助活化因子1a (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator1-alpha, PGC-1a)、核呼吸因子1(nuclear respiratory factor-1, NRF-1)及线粒体转录因子A (mitochondrial transcription factor A, Tfam)在mRNA和蛋白水平的表达；应用凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay, EMS A)检测关键的线粒体转录因子Tfam的活性变化。结果1.与慢性对照组相比,慢性癫痫组大鼠海马组织PGC-1a, NRF-1及Tfam的mRNA表达明显增高(p<0.05)。2.与慢性对照组相比,慢性癫痫组PGC-1a及NRF-1的蛋白表达明显增高(p<0.05),线粒体内Tfam蛋白的水平明显增高(p<0.05)。3.与慢性对照组相比,慢性癫痫组线粒体转录因子Tfam的转录活性明显降低(p<0.05)。结论反复的癫痫发作使得线粒体生物合成的调控因子PGC-1a, NRF-1及Tfam的mRNA及蛋白水平呈现代偿性增高,但是与对照组相比转录因子Tfam的转录活性显著降低,说明反复的癫痫发作可能通过某种机制抑制了线粒体转录因子的转录活性,从而使得代偿性的线粒体保护机制-线粒体生物合成呈现抑制状态。对于线粒体生物合成的深入研究可能会为癫痫的发病机制及治疗靶点的选择提供-些新的理论依据。