研究目的雷公藤多苷（GTW）具有抗炎、免疫抑制、抗生育、抗肿瘤等药理作周,临床上广泛应用于治疗紫癜性肾炎、肾小球肾炎、红斑狼疮、肾病综合征、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、子宫肌瘤、子宫内膜异位症等疾病,其疗效显著。由于部分医家过分担心其生殖损伤,致临床应用出现较大分歧。目前有关GTW对小儿生殖损伤的研究很少,而且实验研究的大多数报道集中在成年鼠进行,因此科学评价临床常规剂量GTW对小儿或幼鼠的生殖损伤、如何尽可能减少或减轻其毒副作用已经成为目前急待研究的课题。因此我们在临床随访GTW生殖损伤的副作用的同时,以SD幼鼠为研究对象进行该实验研究。本研究通过临床使用常规剂量GTW对SD幼鼠生殖损伤情况及损伤后是否具有可逆性以及使用补肾中药（菟丝子黄酮、六味地黄丸）对生殖损伤的干预作用进行了实验研究,为临床安全合理应用GTW提供客观依据。研究方法1体外实验1.1含药血清与正常血清制备3周龄SD雌鼠24只,随机分为4组:空白对照组（A组）、GTW组（B组）、GTW加六味地黄丸组（C组或六味地黄丸组）、GTW加菟丝子黄酮组（D组或菟丝子黄酮组）,每组6只。A组每日予0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）0.5ml/100g;B组每日予,GTW混悬液,剂量为9 mg/kg.d,用0.5%CMC-Na液配成0.9mg/0.5ml的混悬液,0.5ml/100g;C组每日灌服GTW用量同上,六味地黄丸用0.5%CMC-Na液配成0.1g/0.5ml的混悬液,0.5ml/100g;D组每日灌服GTW用量同上,菟丝子黄酮用0.5%CMC-Na液配成0.01g/0.5ml（生药0.1 g）的溶液,0.5ml/100g。各组均连续给药7天,在末次灌胃后1～2小时（h）内,用10%的水合氯醛腹腔麻醉,腹主动脉采血,2500r/分钟（min）离心20min,合并收集同组血清,56℃水浴灭活30min,过滤膜除菌,供细胞培养使用。1.2含药血清对离体培养SD幼鼠卵巢颗粒细胞分泌雌二醇、孕酮及细胞增殖的影响3周龄SD雌鼠20只,腹腔注射孕马血清促性腺激素（PMSG）66IU/只,48h后脱臼处死幼鼠分离卵巢颗粒细胞（GC）,将细胞混悬液按所需密度分别接种于3张96孔培养板中进行原代细胞培养,培养48h后每张选取中央30孔,分5组（除上述4组外加胎牛血清组,即E组）,每组6孔,每孔分别加入各组血清继续培养,分别于12h、24h、48h各取1板,吸取上清液,采用放射免疫法检测雌二醇（E₂）、孕酮（P）浓度。分别在加含药血清后0h、12h、24h、48h吸取上清液的培养板中每孔加入20ul甲基噻唑基四唑（MTT）、180ul DMEM,MTT终浓度为0.5 mg/ml,继续孵育4h,吸取上清液每孔加入150ul二甲基亚砜（DMSO）,结晶充分溶解后,酶标仪上选择490nm、630 nm双波长测定各孔光密度（OD）值,记录结果。1.3含药血清离体培养SD幼鼠卵巢颗粒细胞Bcl-2蛋白表达的影响将单细胞悬液接种于2张24孔培养板中,培养48h后每张选取15孔,分为5组,每组6孔,分别加入各组血清,培养24h后吸去上清液,多聚甲醛固定,采用免疫组织化学SP法检测Bcl-2蛋白表达。2体内实验2.1菟丝子黄酮干预GTW所致生殖损伤的SD幼鼠卵巢组织Bax蛋白表达的影响3周龄SD雌鼠40只,随机分为4组,每组10只,其分组方法、给药剂量同第一部分。连续给药12周,禁食12h,用10%水合氯醛腹腔麻醉,剖取卵巢,甲醛固定,采用免疫组织化学SP法检测卵巢组织促凋亡蛋白Bax。2.2菟丝子黄酮干预GTW所致雌性幼鼠生殖能力的影响及可逆性的观察3周龄SD雌鼠100只,随机分为4组,每组25只,其分组方法、给药剂量同第一部分。连续给药12周,将所有实验雌鼠分笼喂养,每笼1只,按1:1比例放入SD成年雄鼠1只,发现阴栓后提出雄鼠分笼喂养,详细记录实验鼠产仔时间、产仔数、称仔鼠0、1、2、3周体重;未孕雌鼠分笼2周后再与有生育力雄鼠合笼观察。将实验雌鼠产仔3周时,禁食12h后称重,用10%水合氯醛腹腔麻醉,剖取肝、肾、子宫、卵巢、胸腺、肾上腺等脏器,称重计算脏器系数。研究结果1体外实验1.1含药血清对离体培养SD幼鼠GC分泌雌二醇、孕酮及细胞增殖的影响在SD幼鼠离体培养的GC培养液中分别加入GTW、六味地黄丸组含药血清,12h、24h测上清液E₂浓度,与空白对照组比较均无统计学意义（p＞0.05）,菟丝子黄酮组与空白对照组相比有极显著性差异（p＜0.01）;而GTW组48h上清液E₂浓度明显降低,与空白对照组相比有极显著性差异（p＜0.01）,中药干预组及胎牛血清组分别与空白对照组相比均无显著性差异（p＞0.05）;12h、24h、48h中药干预两组上清液E₂浓度均较GTW组高,菟丝子黄酮组高于六味地黄丸组,统计学分析12h、24h均有极显著性差异（p＜0.01）,48h有显著性差异（p＜0.05）。SD鼠离体GC上清液中P浓度在24h、48h胎牛血清组最低,分析这一结果可能与SD鼠离体GC需要特定的成分刺激才会分泌P有关,其原因有待进一步探讨;分别加入GTW组及中药干预组含药血清12h所测上清液P浓度均较空白对照组高,统计学分析均有显著性差异（p＜0.05）,24hGTW组和六味地黄丸组GC分泌P明显增多,与空白对照组相比均有显著性差异（p＜0.05）,空白对照组与菟丝子黄酮组相比无显著性差异（p＞0.05）;48h使用GTW各组上清液P浓度均值均有所下降,分别与空白对照组相比,GTW组有显著性差异（P＜0.05）,其他两组无显著性差异（p＞0.05）。细胞增殖OD值在12h、24h两个时点以六味地黄丸组最高,12h与空白对照组相比有极显著性差异（p＜0.01）,24h无显著性差异（p＞0.05）,但24h后六味地黄丸组OD值逐渐下降,而胎牛血清组和空白对照组OD值则逐渐上升,胎牛血清组最高,其次是空白对照组,提示随着时间的推移六味地黄丸对GC的增殖作用逐渐减弱,胎牛血清组和空白对照组对GC的增殖作用逐渐增强,GTW组对GC的增殖作用最弱,提示GTW具有抑制细胞增殖的作用;12h、24h、48h三个时点GTW组与空白对照组相比均有极显著性差异（p＜0.01）,48h六味地黄丸组与空白对照组相比有极显著性差异（p＜0.01）,菟丝子黄酮组与空白对照组相比有显著性差异（p＜0.05）;三个时点中药干预各组OD值均值较GTW组高,以菟丝子黄酮组最明显,统计学分析均有极显著性差异（p＜0.01）,菟丝子黄酮组与六味地黄丸组相比有显著性差异（p＜0.05）。1.2含药血清对离体培养SD幼鼠卵巢颗粒细胞Bcl-2蛋白表达的影响Bcl-2蛋白在空白对照组和胎牛血清组表达最强,两组间统计学分析无显著性差异（p＞0.05）,在GTW组表达最弱,与空白对照组相比统计学分析有极显著性差异（p＜0.01）;Bcl-2蛋白在六味地黄丸组和菟丝子黄酮组的表达较GTW组强,两组间统计学分析无显著性差异（p＞0.05）,分别与GTW组相比均有极显著性差异（p＜0.01）,与空白对照组相比均有显著性差异（p＜0.01,p＜0.05）。2体内实验2.1菟丝子黄酮干预GTW所致生殖损伤的SD幼鼠卵巢组织Bax蛋白表达的影响Bax蛋白在GTW组SD鼠的卵巢组织中表达最强,其次是六味地黄丸组,分别与空白对照组相比均有极显著性差异（p＜0.01）,空白对照组与菟丝子黄酮组相比无显著性差异（p＞0.05）;GTW组与六味地黄丸组相比无显著性差异（p＞0.05）,与菟丝子黄酮组相比有极显著性差异（p＜0.01）;中药干预两组间有极显著性差异（p＜0.01）。2.2菟丝子黄酮干预GTW所致雌性幼鼠生殖能力的影响及可逆性的观察各组实验SD雌性幼鼠体重增长未见明显异常,随着给药时间的延长,体重逐渐增加,给药4周、12周时菟丝子黄酮组体重均值最高,六味地黄丸组略低于空白对照组,但统计学分析均无显著性差异（p＞0.05）。连续给药12周后合笼受孕率（产仔率）为空白对照组最高（95.8%）,其次是菟丝子黄酮组（91.3%）,GTW组最低（90.0%）,但统计学分析无显著性差异（p＞0.05）;使用GTW各组产仔鼠未发现外观及生殖器畸形;对仔鼠3周存活率无影响,各组间统计学分析无显著性差异（p＞0.05）;未受孕实验雌鼠进行第2次合笼总受孕率为空白对照组为95.8%,使用GTW各组均达100.0%,由此可见,GTW所致生殖损伤具有可逆性;仔鼠3周存活率由高到低,依次是菟丝子黄酮组（97.5%）、六味地黄丸组（97.3%）、GTW组（97.0%）、空白对照组（96.8%）,统计学分析无显著性差异（p＞0.05）。需要说明的是空白对照组的1只鼠因过度肥胖19周体重达483g（本组平均体重为329.7±49.7g）,合笼2次都未受孕,另1只鼠第1次产仔7只全部死亡,第2次合笼后未受孕,提示鼠过度肥胖也可出现不育现象。各组产仔鼠0周体重均值菟丝子黄酮组最高,六味地黄丸组最低,而第3周体重均值空白对照组最高,GTW组最低,但各组间比较均无显著性差异（p＞0.05）。各组实验雌鼠停药7周后卵巢脏器系数均值空白对照组与六味地黄丸组相等,GTW组偏低,组间统计学分析无显著性差异（p＞0.05）,提示GTW对SD幼鼠卵巢脏器系数无明显影响或停药7周后卵巢已自然修复;菟丝子黄酮组均值高于空白对照组,组间统计分析均有显著性差异（p＜0.05）,分析这一结果可能与菟丝子黄酮能促进机体产生内源性雌激素的作用有关。六味地黄丸组实验鼠子宫脏器系数均值较空白对照组低,考虑与GTW合用后可能引起了药物药代动力学和/或药效学改变加重了子宫的损伤;其他两组均值均高于空白对照组,提示GTW对SD幼鼠子宫脏器系数无明显影响或停药7周后子宫已自然恢复,应结合病理组织学检查、激素水平结果作进一步判断。各组实验雌鼠胸腺、肾上腺脏器系数均值由高到低,依次是菟丝子黄酮组、空白对照组、六味地黄丸组、GTW组,统计学分析均有极显著性差异（p＜0.01）,提示GTW对实验鼠的胸腺、肾上腺均可能有一定的毒性,停药7周后还未完全恢复,其损伤机制可能与GTW抑制免疫的作用有关;菟丝子黄酮对抗GTW所致雌性幼鼠胸腺、肾上腺萎缩的作用优于六味地黄丸。GTW组肾脏脏器系数均值较空白对照组低,其他两组均高于空白对照组,统计学分析无显著性差异（p＞0.05）。使用GTW各组肝脏脏器系数均值较空白对照组高,统计学分析无显著性差异（p＞0.05）。研究结论1 GTW含药血清对离体SD鼠原代GC有一定影响。表现在上清液E₂浓度降低、细胞增殖能力下降和抑制Bcl-2蛋白表达;菟丝子黄酮和六味地黄丸均能调节GC分泌甾体激素,通过促进Bcl-2蛋白表达,调整GTW所致幼鼠失衡的生殖激素含量,减少GC凋亡。菟丝子黄酮优于六味地黄丸。2 GTW对SD雌性幼鼠生殖系统有一定的影响,表现在幼鼠卵巢组织Bax蛋白表达增强;菟丝子黄酮、六味地黄丸对GTW所致生殖损伤均有一定的保护作用。其机制是通过调节卵巢组织的表皮生长因子,抑制Bax蛋白的表达,恢复Bcl-2/Bax的正常比值来实现的;对卵巢的保护作用菟丝子黄酮优于六味地黄丸。3 GTW所致SD雌性幼鼠生殖损伤具有可逆性,GTW在性成熟前期用药对雌性幼鼠成年后的受孕、妊娠、产仔过程以及子代的生长发育无明显影响。4 GTW对SD雌性幼鼠胸腺、肾上腺的影响具有迟滞性;菟丝子黄酮干预GTW所致雌性幼鼠胸腺、肾上腺损伤的作用优于六味地黄丸。5菟丝子黄酮在本次体内外实验中对抗GTW所致SD鼠生殖损的作用较为显著,推测菟丝子黄酮一方面作用于GC,通过调控凋亡相关基因Bcl-2/Bax比值,调节卵巢自分泌-旁分泌平衡,抑制GC凋亡,减缓卵泡的闭锁;另一方面通过调节GC分泌甾体激素、细胞因子的能力来保护卵巢的功能。二者相互影响,相互协调,共同促进被GTW损伤的生殖功能的恢复。