新型强效TRAIL融合蛋白的制备、抗肿瘤活性及其机制的研究

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传统的放疗和化疗在杀伤肿瘤细胞的同时,对正常细胞也有较大损伤,导致病人预后不良以及生存质量下降。因此,研发精准靶向肿瘤细胞的治疗方案迫在眉睫。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand,Apo2L/TRAIL)属于 TNF 超家族,是天然抗肿瘤免疫反应的重要成分之一。它通过作用于激活型受体DR4(Death Receptor 4)和DR5(Death Receptor5),特异性诱导肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞没有损伤,该特征使其有潜力成为理想的抗肿瘤药物。然而,重组可溶型TRAIL以及多种TRAIL受体激动剂在临床试验中无论单用还是和其他化疗药物联用,均未获得令人满意的临床疗效。因此对TRAIL进行增效改造,成为相关研究领域的必然趋势,其中构建TRAIL融合蛋白是常用的手段之一。我们采用不同的策略,设计四种融合方案,构建了八种全新的TRAIL融合蛋白,经文献检索,这些新型融合蛋白属于首次构建。经表达、纯化和复性,可获得有活性的融合蛋白产物,利用MTT实验对它们的体外抗肿瘤活性进行检测和筛选,希望获得具有优秀抗肿瘤活性的TRAIL。其中,融合有EGFR(epidermal growth factor receptor)亲和多肽 TGF3L(the 3rd loop of tumor growth factor α,TGF3L)的“双靶向”TRAIL融合蛋白活性增强最为显著,其对肿瘤的杀伤作用相对于TRAIL可提高数百至数千倍,特别是在人结肠癌细胞Co1o205和人乳腺癌细胞MDA-MB-468中,其LC50相对于TRAIL分别降低了 3,000倍和1,000倍,并且对非肿瘤细胞没有损伤。因此,我们对TGF3L-TRAIL融合蛋白活性增强的机制进行了深入探索。为探究TGF3L-TRAIL的EGFR靶向性和凋亡诱导活性,我们进行了受体结合、抗体阻断、凋亡检测、caspase酶活性检测等实验。结果表明,TGF3L-TRAIL对EGFR并没有明显的亲和力。TGF3L-TRAIL能以不同于TRAIL的模式激活DR4和DR5,并能高效活化caspase-8/3,诱导肿瘤细胞凋亡。我们发现TGF3L-TRAIL能够自发组装成一种稳定的高聚体,分子量约为0.8~5×106Da。该高聚体的形成依赖于金属离子、His-tag和TGF3L短肽的协同作用。并且,TGF3L-TRAIL抗肿瘤活性的增强,高度依赖于该聚体的形成。在Colo205移植瘤模型中,TGF3L-TRAIL表现出优于TRAIL的体内抗肿瘤活性。我们尝试将一种来源于人铜离子转运蛋白(human copper transporter 1,CTR1)的金属亲和性短肽—NCTR25,替代上述TGF3L-TRAIL的N-端His-tag人工标签,构建NCTR25-TGF3L-TRAIL和NCTR25-TRAIL两种新型融合蛋白。它们与His-TGF3L-TRAIL一样,可形成稳定的分子量为107-108Da的高聚体,高聚体的形成同样依赖于金属离子,并具有比TRAIL增强10,000-20,000倍的肿瘤细胞选择性杀伤毒性和有效的体内抗肿瘤活性。NCTR25-TRAIL具有与NCTR25-TGF3L-TRAIL同样的理化特征及生物活性,这说明TGF3L多肽对TRAIL高聚体的形成以及活性的增强并非不可或缺。以这两种TRAIL高聚体为工具,我们研究了多价配体对受体激活和信号转导的特征,发现这两种高聚体TRAIL可特异性激活DR4和DR5而非其他TNFRSF受体;高聚体TRAIL对受体亚型的选择性不同于TRAIL,且这种选择性可能因细胞种类差异而表现不同;它们能以更高的效价强度激活caspase通路、诱导肿瘤细胞的凋亡,但最大效能与TRAIL类似,这与文献报道一致;而在活化NF-κB信号通路时,多聚体TRAIL不但具有更高的效价强度,还具有更高的效能,这是我们的首次发现;TRAIL以及高聚体TRAIL均主要通过DR5介导NF-κB的活化。综上所述,我们成功构建并制备了多种新颖的TRAIL融合蛋白;发现三种新型TRAIL融合蛋白能够自发形成高聚体,具有极高的体外活性;这些多价TRAIL配体具有专一的受体选择性,在激活相关信号通路时,表现出比TRAIL更高的效价强度,并首次观察到多价配体具有比TRAIL更高的效能。本研究为新型抗肿瘤蛋白质药物的开发奠定了实验和理论基础;将人源金属亲和短肽与TRAIL融合,可能作为一种新的策略用于开发更高效的蛋白质药物。
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