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研究背景及目的 肝脏损伤与肝纤维化的关系密切，各种病因所致的肝脏损伤引起局部的炎症，继而成纤维样细胞增生并由此导致肝内细胞外基质成分(extracellular matrix,ECM)异常沉积形成肝纤维化。肝纤维化是慢性肝病共有的重要病理特征，也是进一步向肝硬化发展的主要中间环节，属可逆性病变。目前对肝硬化尚缺乏有效的治疗手段，因此对肝纤维化的研究成了近20年世界医学攻关的一个热点。有关肝纤维化发生机制的研究取得了长足的进展，但迄今为止肝纤维化发生的确切机制尚未明确，阐明肝纤维化发生机制并寻求有效的治疗方法具有重要临床意义。 肝纤维化发病机制的复杂性日趋明显，需要用更新的技术手段来阐明。cDNA微阵列技术(cDNA microarray technology)，又称基因芯片技术(gene chip technology)，可同时检测成百上千个基因的表达。自从九十年代初以美国Affymetrix公司Fodor等首先开展基因芯片技术以来，该技术已被成功地应用于基因功能研究的各个领域，进行的大规模基因表达已成为研究病理生理过程的卓有成效的研究方法。但有关cDNA微阵列技术研究肝纤维化发病机制的报道极少。应用该技术寻找急、慢性肝损伤时差异表达的基因，将有助于阐明肝纤维化的发病机制，并为诊断和治疗肝纤维化提供新的靶点。为此我们进行了以下研究筛选肝脏损伤相关基因，并利用RNA干扰技术初步研究其在肝纤维化中的作用。实验包括四部分：1)cDNA微阵列筛选急性肝损伤相关基因；2)cDNA微阵列筛选肝纤维化相关基因；3)有丝分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路相关基因在肝纤维化形成过程中的表达；4)细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERK)基因在大鼠肝星状细胞中的作用。 实验方法 一．cDNA微阵列筛选急性肝损伤相关基因 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，分别用95％肝切除术和皮下注射四第二军医大学博士论文中文摘要氯化碳(c arbon tetrachioride，Ccl4)两种方法制备急性肝损伤大鼠模型，随机分为手术造模组(n=10)、手术对照组(n=10)、CCI;造模组(n=5)和Ccl‘对照组 (n=5)。手术造模组大鼠行95%肝切除，手术对照组剖腹牵拉肝组织后缝合，术后48hr取肝组织;CCI;造模组大鼠皮下注射60%(v/v)cCI;，CC14对照组皮下注射等体积精制橄榄油，注射后48hr取肝组织。将上述4组大鼠肝组织的mRNA提取后，制备成cDNA探针，与含1 176条大鼠基因的微阵列进行杂交及扫描，计算机数据处理分析后两组数据比较。同时比较造模组和对照组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(Al丁)、天门冬酸氨基转移酶(AST)、凝血酶原时间(PT)和肝组织病理学的变化。采用半定量逆转录聚合酶链反应(reversetranscription pol卿erase ehain reaetion，盯一PeR)验证部分基因的表达。 二.cDNA微阵列筛选肝纤维化相关基因 雄性SD大鼠85只，随机分为二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine，nNIN)造模组(n=20)、DMN对照组(n=15)、CCI;造模组(n=30)和CC14对照组(n=20)，分别用DMN和cCI;诱导大鼠肝纤维化。DMN组于用药1周、2周、3周分别提取肝组织总RNA，CC14组于用药2周、4周、6周、8周分别提取肝组织总RNA，4组分别分离纯化mRNA，逆转录并用[a一33PldATp制备探针，与含1 176个基因的大鼠cDNA微阵列杂交及洗涤，信号检测，微阵列图像分析，计算机软件处理数据，将所得的数据进行比较。数据分析，总结与肝纤维化形成相关的信号通路。采用半定量RT一PCR验证部分基因的表达。 三.MAPK信号通路相关基因在肝纤维化形成过程中的表达 采用Northem印迹法(Northem Blot)验证部分MAPK信号通路相关基因如ERK一、蛋白激酶C一eta(protein kinase C eta type，pKC一eta)和核糖体蛋白56激酶(rsbosomal protein 56 kinase，RSK)在转录水平的表达;采用免疫组织化学法检测信号通路关键基因一ERK在肝纤维化形成过程中蛋白水平的表达和定位及其与I、111型胶原表达的相关性。 四.ERK基因在大鼠肝星状细胞中的作用 免疫细胞化学法检测信号通路核心基因一ERK分别在原代培养的肝星状细胞(hepatie stellate eell，HsC)和活化的HsC株Hse一T6中的表达和定位。设计和合成针对ERKI mRNA靶序列的小干扰胭A(small inierfering RNA，51胭A)，第二军医大学博士论文中文摘要构建干扰RNA的真核表达载体，电穿孔转入HSC一T6，G418筛选建立稳定表达细胞株。对RNA干扰前后的HSC一T6，分别用RT一PCR、Westem blot及免疫细胞荧光染色法检测ERKI的表达变化;MTS检测加入血小板衍生生长因子(platelet一derived growth factor，pDGF)前后细胞增殖情况的变化;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡指数的变化。 实验结果 一cDNA微阵列筛选急性肝损伤相关基因 急性肝损伤造模组与对照组外周血转氨酶有明显差异，造模组ALT和AST较对照组升高5倍以上(尸<0.05);大鼠肝大部切除前后PT有明显差异，手术前PT为8.42士1.43 se。，手术后PT为27.46士14.08 see，手术后PT较术前组延?