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防御素(defensins)是生物体在抵御病原微生物的防御反应过程中产生的一类重要的抗菌肽类物质。它具有十分广泛的抗菌谱,可以抵抗细菌、真菌、被膜病毒等多种微生物,尤其是哺乳动物防御素除了对细菌、真菌、被膜病毒有毒杀作用外,还对支原体、衣原体、螺旋体及一些恶性细胞有杀伤作用。由于其独特的抗菌机制,不会诱发细菌的耐药性,成为具有巨大发展潜力的新型抗菌药物。猪β防御素-1(porcineβ-defensin 1,PBD-1)是广泛分布于猪消化道、呼吸道、肝、肾等多种组织细胞内的一类活性多肽,在猪防御系统中起重要作用,大量研究结果证明PBD-1具有独特的作用机制,病原菌不易对其产生耐药性。它可被用作食品保鲜剂和饲料添加剂,随着对其研究的深入,可以相信猪防御素将在动物养殖、疾病预防和提高畜产品品质等方面发挥更大作用。近年来,随着基因工程技术的发展,人们希望通过生物工程手段来大量生产防御素。由于生物体内天然防御素的含量很低,且提取步骤繁琐,而化学合成法成本高,因此用基因工程方法大量生产防御素无疑是最佳选择。本研究的目的就是在克隆猪舌上皮防御素的基础上,根据毕赤酵母密码子偏好性设计并人工合成防御素成熟肽,并利用毕赤酵母表达系统实现二者在体外的分泌表达,以期获得更高活性的防御素产品,为猪防御素的工程化生产和畜牧养殖业奠定基础。本实验以健康猪新鲜猪舌上皮粘膜为实验材料,以GenBank中报道的猪防御素PBD-1的cDNA序列及表达载体pPIC9多克隆位点为基础设计引物,其中上游引物含有EcoRⅠ酶切位点,下游引物含有NotⅠ酶切位点。采用RT-PCR技术扩增出PBD-1基因的cDNA序列,将其克隆到pGM-T载体中进行序列测定。利用PCR技术从含有PBD-1基因的重组质粒中扩增PBD-1基因编码区,大小为151 bp,然后插入到分泌型表达载体pPIC9的EcoRⅠ和NotⅠ位点,构建重组表达质粒pPIC9-PBD-1;又根据毕赤酵母偏好密码子设计并人工合成PBD-1M基因,全长159 bp。基因N端引入α-信号肽kex2和Ste13裂解位点,以保证表达产物具有天然N端,两端引入XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点。将合成的目的基因片段克隆入表达载体pPIC9中,构建重组表达载体pPIC9-PBD-1M。用BglⅡ将pPIC9-PBD-1和pPIC9-PBD-1M线性化后,采用电穿孔法转入毕赤酵母GS115中进行表达。以重组酵母菌液为模板,经PCR检测约70%的转化子已正确整合入毕赤酵母染色体中。阳性克隆经摇瓶发酵和甲醇诱导,发酵上清液经浓缩处理后进行Tricine-SDS-PAGE分析,利用琼脂孔穴扩散法检测抑菌活性。结果表明,防御素PBD-1在毕赤酵母中得到表达,表达产物对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抑菌活性。改造后基因抑菌效果更明显,从而进一步证实了密码子偏好性对其表达水平的重要影响。