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皮肤的衰老与其他器官不同,不仅要经历自然老化也要经历多种外界环境因素加速的老化。导致皮肤老化的外界因素众多,如紫外线、红外线、化学烟雾和粉尘等。这些因素中以紫外线引起的皮肤老化(光老化)现象最为显著。随着人们生活水平的不断提高,对皮肤保健也不断重视,人们开始采取多种方法预防和治疗皮肤老化。皮肤的健康、美丽在分子水平主要取决于真皮层有大量有序的胶原网状结构存在。老化皮肤中胶原纤维合成减少,降解加速,导致其有序致密的胶原网状结构丧失,最终导致皮肤松弛和皱纹。因此I型和III型胶原蛋白合成的增加或者降解的抑制成为治疗皮肤老化的重要目标。本论文的目的就是从大量的天然植物单体中筛选并找到能够激活和促进皮肤成纤维细胞表达胶原蛋白的天然活性物质,之后从细胞和动物水平证明该物质促胶原表达效果,最后探讨该药物的分子机制,为日后开发抗皱纹、抗光老化的护肤产品提供理论依据。一、构建人I型胶原α2蛋白亚基的报告质粒并筛选天然药物单体建立I型胶原α2蛋白(Collagen Type I α 2,COL1a2)的启动子区域的荧光素酶(Luciferase)报告质粒,将重组的报告质粒和内参质粒共转染入皮肤细胞,之后在细胞安全的浓度范围对促进胶原蛋白转录的天然药物单体进行筛选。通过比较104种待测的候选物质,发现鹰嘴豆芽素B具有显著促进成皮肤成纤维细胞上调COLla2胶原蛋白转录活性的作用。二、鹰嘴豆芽素B通过调节TGF-p/Smad信号通路促进皮肤成纤维细胞胶原蛋白的表达首先,通过MTS实验确认鹰嘴豆芽素B对皮肤成纤维细胞的安全浓度为低于200 μM;之后选取150μM浓度范围内的鹰嘴豆芽素B处理细胞,通过流式细胞发现鹰嘴豆芽素B不影响细胞分裂周期;利用实时定量PCR和免疫印迹的实验手段发现该药物在100 μM浓度范围能够促进皮肤成纤维细胞表达前胶原分子,对MMPI表达有轻微的抑制效果;通过Western Blot技术发现药物能促进Smad2/3磷酸化水平的提高,表明药物促进胶原蛋白合成效果是通过上调Smad2/3信号通路磷酸化实现的。为进一步研究药物在细胞的水平对光老化的防护效果,我们将药物加入到紫外照射的细胞中,发现在25 mJ/cm2(半致死照射剂量)下,药物能够减轻紫外线导致的细胞活力降低,下调细胞中活性氧簇产生;同时使用JC1荧光探针发现药物能够提高线粒体膜电位,证实鹰嘴豆芽素B能够逆转紫外光对皮肤细胞的损伤。三、长期和短期动物实验证实鹰嘴豆芽素B通过调节TGF-β/Smad信号通路缓解皮肤老化利用SKH-1无毛小鼠持续12周药物涂抹及紫外照射实验及裸鼠短期2周药物涂抹实验。PCR、Western Blot和IHC结果表明鹰嘴豆芽素B治疗能够促进小鼠皮肤胶原蛋白的表达,抑制MMP1的表达。扫描电镜和透射电镜观察到药物治疗组小鼠中皮肤胶原纤维排列致密;同时,Smad2/3磷酸化水平也显著增加。实验结果表明药物能够通过上调TGF-β/Smad信号通路促进无毛鼠皮肤中胶原的表达,改善皮肤结构。但是在紫外照射的情况下,我们发现短期涂抹药物没有显著提高胶原表达,这与细胞水平的结果一致,暗示药物的能够只能减少紫外引起的细胞损伤和ROS积累。结论:1、成功建立了一种含有Ⅰ型胶原蛋白启动子的双荧光素酶报告载体,该载体是进行体外筛选促胶原蛋白合成的药物一个高效可靠的工具。2、通过体外筛选发现鹰嘴豆芽素B在安全剂量之内能显著促进皮肤胶原蛋白的表达,另外该药物具有抗紫外光氧化功能。3、本研究表明鹰嘴豆芽素B通过激活TGF-β/Smad信号通路上调皮肤胶原蛋白的表达。