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第一部分 DJ-1 通过 CaMKKβ/CaMKIV/CREB 通路调节酪氨酸羟化酶表达的机制研究目的:脑内酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的表达下降是帕金森病患者的发病标志。Parkinsonism associated deglycase DJ-1)基因的缺失或突变导致早发遗传性帕金森病。本课题的研究目的是探究帕金森病相关蛋白DJ-1调控TH表达的分子机制。方法:首先采用RNAiMax转染体外培养的Neuro-2a(N2a)细胞系,通过small interfering RNA(siRNA)敲低Dj-1基因的表达,构建DJ-1缺陷细胞模型。Quantitative Real-time PCR(qRT-PCR)检测模型多巴胺(dopamine,DA)合成代谢相关酶的messenger RNA(mRNA)水平。利用蛋白免疫印迹法在DJ-1缺陷细胞模型和Dj-1全身敲除(KO)小鼠模型黑质区进一步验证DA合成代谢相关酶的蛋白水平。为了探究Dj-1基因通过何种信号通路调节TH的表达,构建野生型及突变体TH的报告基因质粒,在人胚肾细胞系(human embryo kidney cells,HEK293)过表达DJ-1,观察野生型及突变体TH的报告基因活性,从转录水平解释调控的分子机制。采用蛋白免疫印迹法检测DJ-1缺陷细胞模型中调控TH表达的上游相关蛋白水平和激酶磷酸化水平,以及在Dj-1 KO小鼠中验证相关通路的改变。利用免疫共沉淀、邻位连接技术和细胞免疫荧光等实验方法,探究在细胞中DJ-1是否与TH上游调控蛋白存在相互作用和共定位。结果:我们在Dj-1敲减细胞和敲除小鼠黑质中,发现TH而非其他DA合成代谢相关酶的表达量比对照组显著降低。进一步研究发现,DJ-1缺乏诱导的TH表达降低是由于TH的转录因子环磷腺苷效应元件结合蛋白1(cAMP-response element binding protein1,CREB1)活性降低所介导,而沉默Creb1可消除由DJ-1缺乏导致的TH表达改变。进一步发现沉默Dj-1通过抑制CREB1的上游激酶Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 IV(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase IV,CaMKIV)Thr196/200的磷酸化水平而抑制CREB1活性。最终,我们发现DJ-1通过直接结合Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶 β(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinaseβ,CaMKKβ)调节CaMKIV/CREB1通路活性而调控TH的转录表达,而DJ-1缺陷导致CaMKKβ/CaMKIV/CREB1通路活性下降而导致TH表达降低。结论:我们的结果阐明了帕金森病相关蛋白DJ-1调控TH表达的新靶点和新途径,即通过直接结合CaMKKβ而调节CaMKIV/CREB1通路活性从而调控TH表达。DJ-1缺陷导致的CaMKKβ/CaMKIV/CREB1通路活性下降和TH表达下调可能是其参与PD发病的机制之一。第二部分帕金森病相关基因NUS1缺失诱导神经毒性的机制研究目的:轴突生长抑制因子B受体(Nogo-B Receptor,NgBR)的编码基因NUS1是新发现的帕金森病风险基因,目前对NUS1基因在中枢神经系统中的作用研究相对缺乏。本研究从细胞及分子水平探讨NUS1缺乏介导的神经毒性及其机制。方法:首先提取和体外培养胎鼠原代皮层神经元。在原代皮层神经元和Neuro-2a(N2a)细胞系中通过RNAiMax转染siRNA敲低Nus1基因的表达,构建Nus1缺陷细胞模型。利用蛋白免疫印迹法验证模型中内质网(endoplasmic reticula,ER)应激相关蛋白的表达水平。qRT-PCR检测模型中内质网应激相关基因的mRNA水平。为了探究沉默Nus1基因的表达是否能激活细胞凋亡通路,利用乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)活性检测试剂盒、qRT-PCR和蛋白免疫印迹法检测NUS1缺陷模型中细胞凋亡及凋亡相关基因的mRNA及蛋白水平。并运用相关信号通路抑制剂Integrated Stress Response Inhibitor(ISRIB)、2-Aminoethoxydiphenyl borate(2-APB)或ER应激诱导剂毒胡萝卜素(Thapsigargin,TG)处理细胞,进一步观察NUS1在这些药物处理下对ER应激相关基因的mRNA及蛋白改变。结果:我们通过qRT-PCR和蛋白免疫印迹发现,在原代皮层神经元中敲低Nus1可以特异性激活蛋白激酶R样ER激酶(Protein kinase r-like ER kinase,PERK)信号所介导的ER应激和诱导ER应激相关蛋白激活转录因子(Activating Transcription Factor 4,ATF4)和 C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的表达。而PERK抑制剂ISRIB可以显著抑制Nusl缺乏诱导的ER应激相关蛋白激活。此外,沉默Nus1激活ER应激介导的细胞凋亡信号通路,包括凋亡蛋白protein 53(p53)、BCL2 associated X(Bax)表达升高及Cleaved-caspase3激活,而ISRIB处理原代皮层神经元能明显抑制沉默Nus1诱导的神经元凋亡。此外,我们还发现沉默Nus1破坏内质网钙稳态,运用钙离子螯合剂2-APB预处理细胞,在一定程度上抑制Nus1缺乏诱导的Cleaved-caspase3激活,提示钙稳态失衡可能参与Nus1缺乏所介导的ER应激及细胞凋亡。结论:Nus1缺失通过激活PERK通路显著诱导ER应激,激活ER应激相关蛋白表达及诱导神经元凋亡,而抑制PERK活性能显著抑制Nus1缺乏诱导的ER应激相关蛋白激活和神经元凋亡。