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埃博拉病毒(EBOV)是一种高致病性病原,可导致人类和其他灵长类高致死性的出血热。历史上最大的埃博拉暴发是2013到2016年发生在西非的流行,造成了将近30,000人感染,超过11,000人死亡。从2018年开始在刚果民主共和国(Democratic Republic of Congo、DRC)蔓延的疫情则导致了比西非暴发更高的病死率,尽管有超过30万人接种了疫苗,但感染人数仍已超过3,400人,死亡病例超过2,200例。面对大型暴发的接连出现以及特效药物的缺失,人们亟需对埃博拉病毒进行更多更深入的研究。然而,埃博拉病毒的研究必需在生物安全四级(Biosafety Level 4、BSL-4)实验室中进行,导致研究进度受到了严重限制。为了能在四级实验室之外进行研究,科学家建立了多种反向遗传学系统来模拟病毒生活周期的不同步骤,其中包括迷你基因组(Minigenome、MG)系统以及能够被转录和复制的病毒样颗粒(transcription-and replication-competent virus-like particle、trVLP)系统。但是,现有的反向遗传学系统都依赖于多种质粒的共转染,包括编码病毒蛋白的多个质粒,编码病毒基因组的质粒以及编码DNA依赖的RNA聚合酶的质粒,使得实验操作和设计都更加复杂,而且能够使用的细胞系也受限于那些具有高转染效率的细胞,比如HEK293T细胞。在第一部分工作中,我们改进了 MG系统,基于Huh7-4P细胞建立了一个可以稳定复制和转录MG的复制子系统。Huh7-4P是稳定表达病毒核衣壳蛋白NP,复制酶辅助因子VP35,转录激活蛋白VP30和聚合酶L的细胞,带有Gaussia荧光素酶和Hygromycin抗性标记的MG可以在Huh7-4P细胞中维持几个月的复制。对病毒基因组RNA(vRNA)、复制中间体RNA(cRNA)以及mRNA水平的分析表明,MG稳定复制子系统比现有的质粒转染系统含有更高的复制水平,因此可以作为更好的研究病毒复制的代替工具。我们还发现,稳定复制子系统中MG的复制对于干扰素或RNA干扰处理都不敏感,提示了这两种治疗方案的局限性。更有意思的是,我们通过使用RNA酶处理复制子细胞裂解液,揭示了 vRNA核糖核蛋白复合体极高的稳定性,为理解埃博拉病毒在康复病人体内的持续存在提供了研究线索。在第二部分的工作中,我们优化了 trVLP系统。通过表型筛选和亚克隆手段,我们从Huh7-4P细胞中获得了病毒蛋白表达水平优化的Huh7-4PX细胞。编码病毒蛋白VP40、GP以及VP24的病毒亚基因组可以在Huh7-4PX细胞中进行高效的复制和转录,产生的亚基因组trVLP也可在该细胞中进行持续的扩增。通过对该trVLP系统进行分析,我们发现其可以做为感染性病毒的代替系统,在生物安全二级(BSL-2)实验室真实地对抗病毒药物和抗体进行评价。同时,我们利用该trVLP系统证明了 DRC暴发中固定下来的病毒VP40突变可以增强trVLP的扩增速率。因此,该trVLP系统也提供了一个研究埃博拉病毒学特性更加方便的工具。