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[目 的]炎症因子 IL-β（Interleukin-1 β,IL-1 β）、Toll-4 受体（TLR-4）、核转录因子（NF-KB）信号通路的激活与机体内炎症反应的发生及细胞凋亡密切相关。本课题组前期的细胞实验模型,证实了透明质酸合成酶2/3（Hyaluronan Synthase 2/3,HAS-2/3）表达下调可直接影响软骨细胞骨架（Cytoskeleton,CSK）的形态及功能,可以在核酸分子水平及蛋白分子水平上调RhoA通路的表达,调节软骨CSK相关蛋白的表达,导致软骨细胞功能退变及凋亡增加。因此HAS-2/3能否通过调控炎症相关因子表达水平上调来促进软骨退变以及HAS-2/3的表达下调是否也在动物水平上调RhoA信号通路的表达水平,进而诱导软骨细胞功能退变,有待进一步的研究。本研究通过细胞实验研究HAS-2/3表达下调后相关炎症因子的表达变化及CSK变化情况,从动物实验层面研究HAS-2/3表达下调后RhoA信号通路的表达情况,探讨HAS-2/3对软骨CSK调控的作用通路,为骨关节炎等相关软骨退行性疾病的早期预防及治疗提供新的方向。[方 法]通过慢病毒载体介导的shHAS-2/3转染C28/I2人正常软骨细胞,构建HAS-2/3基因沉默细胞模型,运用细胞免疫荧光,激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM）方法检测 HAS-2/3 表达下调后,炎症相关因子IL-β、TLR-4、NF-KB P65的表达情况及观察CSK破坏程度,探讨上述因子在软骨CSK破坏中的作用机制。同时通过膝关节腔内注射shHAS-2/3沉默HAS-2/3基因构建实验动物模型,运用RT-PCR、Western Blot等分子生物学手段检测实验动物软骨细胞中HAS-2/3、RhoA/ROCK1/ROCK2 mRNA和HAS-2/3、RhoA/ROCK1/ROCK2的蛋白表达水平,探讨HAS-2/3下调在动物水平对RhoA信号通路的影响;通过病理标本包埋,HE染色,观察HAS-2/3表达下调对软骨细胞的影响;运用免疫组织化学,观察HAS-2/3表达下调在动物水平对软骨CSK相关蛋白的影响。[结 果]1、细胞实验:沉默HAS-2/3后,（1）细胞免疫荧光,LSCM检测IL-1 β的表达量及软骨CSK情况,结果表明,HAS-2/3与IL-1 β存在显著的相关性（P<0.05）,HAS-2/3沉默后,实验组软骨细胞中IL-1 β的表达水平显著升高,CSK破坏严重程度与IL-1 β的表达水平具有显著的相关性（P<0.05）;（2）软骨细胞免疫荧光,LSCM检测TLR-4的表达量及CSK情况,结果表明,HAS-2/3与TLR-4存在显著的相关性（P<0.05）,HAS-2/3沉默后,实验组软骨细胞中TLR-4的表达水平显著升高,CSK破坏严重程度与TLR-4的表达水平具有显著的相关性（P<0.05）;（3）细胞免疫荧光,LSCM检测的NF-KB P65表达量及软骨CSK情况,HAS-2/3与NF-KB P65存在显著的相关性（P<0.05）,HAS-2/3沉默后,实验组软骨细胞中NF-KB P65的表达水平显著升高,CSK破坏严重程度与NF-KB P65的表达水平具有显著的相关性（P<0.05）。2、动物实验:通过慢病毒转染技术沉默HAS-2/3基因后,实验组关节软骨出现退行性改变。（1）HE染色:实验组（sh-HAS2组、sh-HAS-3组）关节软骨组织软骨层变薄,细胞数目减少,部分细胞体积缩小,排列不规则,可见纤维化改变,出现软骨组织损伤情况。（2）Vimentin免疫组织化学:实验组（sh-HAS2组、sh-HAS3）中阳性细胞数明显减小,大鼠软骨组织浅层、中层可见少许阳性细胞,深层阳性细胞数目极少,关节软骨CSK破坏。（3）tublin免疫组化结果显示:实验组（sh-HAS2组、sh-HAS3）组中阳性细胞数明显减小,浅层阳性细胞数较对照组未见明显差异,但在软骨中层及深层组织中阳性细胞数目极少,关节软骨CSK相关蛋白表达减少,CSK破坏。（4）RT-PCR检测HAS-2、HAS-3及RhoA/ROCK1/ROCK2信号通路mRNA表达情况,实验组HAS-2、HAS-3mRNA 表达水平明显下降（P<0.05）,RhoA/ROCK1/ROCK2mRNA 表达水平明显上调（P<0.05）;（5）W-B检测HAS-2、HAS-3及RhoA/ROCK1/ROCK2蛋白表达水平,实验组HAS-2、HAS-3蛋白表达水平明显下降（P<0.05）,RhoA/ROCK1/ROCK2蛋白表达水平明显上调（P<0.05）。[结 论]1.HAS-2/3表达下调会导致IL-1 β的表达上调,NF-KB信号通路的激活,出现软骨CSK破坏,说明HAS-2/3对软骨细胞炎症反应具有调控作用,对软骨CSK维持具有保护作用;2.在动物实验中,通过膝关节腔内注射shHAS-2/3慢病毒转染技术,可在动物水平抑制关节软骨细胞中HAS-2/3的表达,使RhoA/ROCK1/ROCK2经典信号通路的mRNA和蛋白水平的表达增加;3.在动物实验中,HAS-2/3中任何一种的表达下调,都会出现关节软骨退变,软骨CSK破坏,其机制可能是HAS-2/3表达下调激活RhoA/ROCK1/ROCK2经典信号通路,导致软骨细胞损伤;4.HAS-2/3在软骨CSK正常功能维持,保护软骨细胞中具有重要作用。