论文部分内容阅读
目的：糖尿病性心肌病（DC），是糖尿病慢性并发症之一，主要表现为心室舒张功能受损，最终发展为心力衰竭，这与糖尿病患者心血管疾病的高发病率和高病死率密切相关。心肌细胞凋亡在DC的形成中起着重要作用，是DC主要的病理特征之一。因此，更好地了解高血糖状态下心肌细胞凋亡的发病机制，为DC的防治提供新的策略是非常必要的。RhoA/Rho激酶（ROCK）信号通路有着“分子开关”的作用，调节着细胞的收缩、粘附、增殖和凋亡等多种生物学行为和功能。有研究表明在心肌缺血再灌注损伤中，ROCK介导了心肌细胞凋亡。本研究通过观察体外高糖条件下心肌细胞的凋亡情况并应用ROCK特异性抑制剂法舒地尔进行干预，探讨RhoA/ROCK通路在诱导心肌细胞凋亡中的作用，旨在为DC提供一个新的治疗靶点。方法：取出生后1-3天的SD大鼠，组织消化法进行心肌细胞体外培养，台盼蓝染色法进行心肌细胞活力鉴定，采用细胞免疫化学法进行心肌细胞鉴定。将心肌细胞分为9组：正常对照组（NG:含5.5mmol/L葡萄糖）、高糖组（HG:含25mmol/L葡萄糖）、高渗透压组（OSM：5.5mmol/L葡萄糖+19.5mmol/L甘露醇）、正常糖浓度+法舒地尔组（50、75和100μmol/L）、高糖浓度+法舒地尔组（50、75和100μmol/L），培养72小时。采用流式细胞术检测心肌细胞的凋亡率并分析细胞周期，应用Western blotting检测磷酸化MYPT1水平、Bax/Bcl-2、caspase3蛋白表达。结果：1高糖和法舒地尔对心肌细胞凋亡的影响：从流式结果分析，与对照组相比，高糖组心肌细胞的凋亡率显著升高（P＜0.01）；与高糖组比较，高糖中加入法舒地尔（50、75和100μmol/L）后，细胞凋亡率显著降低（P＜0.05，P＜0.01和P＜0.01），且三组之间两两比较有统计学差异（P＜0.05）；当高糖中加入法舒地尔100μmol/L时，凋亡率与对照组相比无显著性差异（P＞0.05）；高渗透压组、正常糖浓度中加入法舒地尔（50、75和100μmol/L）与对照组相比细胞凋亡率无显著性差异（P＞0.05）。2高糖和法舒地尔对心肌细胞周期的影响：从细胞周期结果分析，与对照组相比，高糖组心肌细胞处于G0期细胞数量显著升高（P＜0.01）；与高糖组相比，高糖中加入法舒地尔（50、75和100μmol/L）后，G0期细胞数量显著下降（P＜0.01），且三组之间两两比较有统计学差异（P＜0.05）；高渗透压组、正常糖浓度中加入法舒地尔（50、75和100μmol/L）与对照组相比无显著性差异（P＞0.05）。高糖组G2期细胞数量较对照组显著下降（P＜0.01）；高糖中加入法舒地尔（50、75和100μmol/L）后，G2期细胞数量较高糖组显著升高（P＜0.01），且三组之间两两比较有统计学差异（P＜0.05）；当法舒地尔浓度为100μmol/L时，与对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。高糖组S期细胞数量较对照组显著下降（P＜0.01）；高糖中加入法舒地尔（50、75和100μmol/L）后，S期细胞数量较高糖组显著升高（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01），且三组之间两两比较有统计学差异（P＜0.05）；当法舒地尔浓度为100μmol/L时，与对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。高渗透压组、正常糖浓度中加入法舒地尔（50、75和100μmol/L）时G2期、S期细胞数量与对照组相比无显著性差异（P＞0.05）。3高糖和法舒地尔对ROCK活性的影响：肌球蛋白磷酸酯酶靶点亚单位1（MYPT1）是ROCK的主要底物之一，磷酸化的MYPT1是ROCK信号通路激活的标志，因此检测磷酸化MYPT1水平来反应ROCK的活性。与对照组相比，高糖组磷酸化MYPT1水平显著升高（P＜0.01)。与高糖组相比，高糖中加入法舒地尔（50、75和100μmol/L）显著抑制了磷酸化MYPT1水平的增加(P＜0.01)；且三组之间两两比较有统计学差异（P＜0.05）；高渗透压组及正常糖浓度中加入法舒地尔（50、75和100μmol/L）与对照组相比无显著性差异（P＞0.05）。4高糖和法舒地尔对Bax/Bcl-2比值和caspase3蛋白表达的影响：各组Bcl-2表达无明显差异（P＞0.05）；与对照组相比，高糖组Bax/Bcl-2比值和caspase3蛋白表达显著升高（P＜0.01）；在高糖中加入法舒地尔（50、75和100μmol/L），Bax/Bcl-2比值和caspase3蛋白表达较高糖组显著下降（P＜0.01），且三组之间两两比较有统计学差异（P＜0.05）。当高糖中加入法舒地尔100μmol/L时与对照组比较无显著性差异（P＞0.05）；高渗透压组、正常糖浓度中加入法舒地尔（50、75和100μmol/L）与对照组相比，Bax/Bcl-2比值和caspase3蛋白表达无显著差异（P＞0.05）。结论:1高糖能够诱导心肌细胞凋亡并将细胞周期阻滞于G0期；2高糖通过激活RhoA/ROCK信号通路，上调Bax和casepase3表达从而介导了心肌细胞凋亡；ROCK抑制剂法舒地尔能够抑制ROCK活性，浓度依赖性地抑制高糖诱导的心肌细胞凋亡。