目的疟疾是疟原虫通过媒介昆虫蚊传播的人类最严重的寄生原虫感染性疾病。据WHO最新报告显示,全世界约33亿的人口生活在疟疾风险区,每年近200多万人因其死亡。尽管基于化疗药物为主的抗疟治疗对降低疟疾的病死率取得了显著成效,但由于耐药原虫和杀虫剂性蚊的出现,单纯的化疗药物已经不能有效地遏制疟疾的流行。因此,开发新型有效抗疟疫苗成为目前疟疾防治亟待解决的重点课题。基于切断疟原虫在人与媒介昆虫蚊之间传播的传播阻断疫苗(TransmissionBlocking Vaccine,TBV)逐渐受到关注。TBV的原理是以有性阶段虫体特异表达的表面靶蛋白作为抗原免疫人体,使之产生抗有性阶段虫体表面蛋白的特异性抗体,从而导致有性阶段疟原虫的进一步发育障碍,阻断疟原虫的传播途径。与疟疾感染阻断疫苗和发病阻断疫苗相比,其优点为:靶虫体明显少于红内期原虫数目;作为疫苗研制障碍的抗原变异少见;通过与药物或其它疟疾疫苗的联合应用可防止耐药性原虫的扩散。更重要的是,从群体角度出发,个体接种疫苗后,受益的将是整个流行区内的人群。因此,有效的TBV的研制开发必将带来明显的社会效益和经济效益。迄今,关于疟疾传播阻断疫苗候选抗原的研究主要集中于蚊阶段虫体表达的特异性蛋白。P48蛋白是表达于疟原虫有性阶段配子体和配子表面的主要蛋白。近年来,在对恶性疟原虫(Plasmodium falciparum,P.falciparum)流行区感染患者研究中发现,由于配子体携带者血清中存在具有传播阻断活性的抗Pfs48表位抗体,其免疫血清在蚊膜喂养实验中能够明显降低配子体向蚊阶段发育的活性。基因克隆及测序结果显示,Pfs48在雄性配子受精过程中高度保守,基因多态性明显少于其他红前期和红内期候选抗原。同时研究发现P48具有半胱氨酸保守行富集序列,高效价的抗体的应答依赖于蛋白表位空间构象的正确折叠。确定疫苗的免疫活性是评价疫苗有效性的前提。核酸疫苗(又称DNA疫苗)能够在宿主体内表达具有构象结构的抗原,诱发机体产生全面的免疫应答,其作为新型疫苗开发策略已广泛应用。目前核酸疫苗已经成功用于疟疾红内及红前期候选抗原的研究,以疟原虫红内及红前期表面抗原构建的核酸疫苗能够诱导宿主高水平的细胞和体液免疫。本研究通过构建约氏疟原虫(Plasmodium yoelii17XL,P.yoelii17XL)Pys48核酸疫苗,免疫实验动物小鼠,动态观察其免疫活性及传播阻断效应,旨在为有效抗疟疫苗的研制开发提供新的理论和实验依据。实验方法1、基因组DNA的提取及核酸疫苗的构建提取P.yoelii17XL基因组DNA,PCR扩增Pys48全基因序列,将该片段插入克隆载体pMD19-T simple,测序鉴定。回收并纯化双酶切产物亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1+,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆。大量扩增阳性重组子,无内毒素质粒提取试剂获得核酸质粒,此即为载有Pys48目的基因的核酸疫苗。2、Pys48核酸疫苗的酶切鉴定LB液体培养基培养阳性重组子过夜,少量提取核酸质粒,进行单、双酶切,琼脂糖凝胶电泳检测。3、实验动物免疫及血清采集将溶于PBS的DV/Pys48,接种于BALB/c小鼠左右大腿肌肉,初次免疫后4w和8w,以等量DV/Pys48两次加强免疫,每次100μg/只。同时设置空质粒和PBS对照组(每组5只)。每次免疫前1-3d尾尖采集各实验组小鼠血液,分离血清,-80℃保存。4、血清特异性抗体检测以溶有配子体抗原(200ng/孔)的碳酸盐缓冲液包被96孔酶标板,4℃过夜;用含1%BSA的PBS封闭1h,以TBS缓冲液1:200稀释免疫后不同时间的小鼠血清,每孔加100μl,室温孵育2h,加1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG+IgM抗体孵育1h,加入底物溶液显色,酶标仪检测492nm处的OD值。5、免疫印迹和免疫荧光实验(1)疟原虫抗原经SDS-PAGE电泳分离,转移PVDF,5%脱脂奶粉的PBS封闭,与血清(1:50稀释)孵育4℃过夜。TBST洗涤后,膜与HRP标记的羊抗鼠IgG+IgM(1:5000)共同孵育2h。TBST洗涤后ECL显影观察。(2)PBS稀释梯度离心分离的配子体,涂布荧光片,冷丙酮固定。用含5%脱脂奶粉的PBS封闭,洗涤,加入抗血清(1:100稀释),37℃孵育60min,FITC标记的羊抗鼠IgG+IgM血清中反应30 min,DAPI染色,封片,荧光显微镜观察。6、传播阻断效应观察心脏采集感染后第3天小鼠血液(肝素抗凝),分装于1.5ml离心管中,10μl/管,离心,去上清。加入含不同浓度免疫血清的动合子培养液,100μl/管。24℃培养24h后,PBS清洗两次,取1μl悬液涂于荧光载玻片上,冷丙酮固定。用含5%脱脂奶粉的PBS 37℃封闭30min。加入抗合子动合子表面蛋白Pys25 McAbs(1:200),清洗后加入FITC标记的羊抗鼠IgG+IgM荧光二抗,孵育30min,封片,荧光显微镜计数合子和动合子的形成数量。实验结果1、目的基因插入克隆载体及测序鉴定测序结果显示插入的目的基因序列与GenBank中Pys48的预测序列相同,酶切鉴定显示目的条带与Pys48片段大小一致。2、Pys48核酸疫苗血清特异性抗体水平变化于初次免疫后4周,疫苗免疫组小鼠血清特异性抗体水平开始出现有意义的升高。两次加强免疫后抗体一直维持于较高水平,尤其是末次免疫后,血清抗体效价高达5000,与正常对照组和空质粒组相比差异显著(P<0.01)。3、特异性抗体对天然抗原的识别免疫印迹杂交实验显示,Pys48核酸疫苗诱导的小鼠血清抗体能够特异性识别天然配子体抗原,免疫荧光分析发现特异性蛋白位于配子体表面。4、传播阻断效应观察与对照组相比,Pys48核酸疫苗诱导的特异性抗血清对合子和动合子形成具有明显的抑制作用,其中1:3倍稀释抗血清的阻断作用较1:9倍稀释的抗血清更为显著。结论成功构建了Pys48核酸疫苗,接种BALB/c小鼠显示出良好的免疫原性,其免疫血清可显著抑制有性阶段原虫的进一步发育。