脂肪沉积和肌肉发育是影响猪肉品质的重要因素,如何提高肌内脂肪含量是改善肉品质的关键。金华猪是我国优良的地方品种,与长白猪相比,它具有肉品质性状优良、肌内脂肪含量高等特点。本课题组前期通过基因芯片等技术筛选得到金华猪和长白猪的品种差异基因GADD45α（生长抑制和DNA损伤诱导基因45α）,其在金华猪背最长肌中的表达显著高于长白猪。但是,GADD45α是否能够调控脂肪沉积特别是肌内脂肪沉积还鲜见报道。目前仅有猪GADD45α基因序列的克隆,但关于猪GADD45α基因结构和功能的研究还未见报道。另外,研究表明GADD45α在白色脂肪组织中高表达,但是对于GADD45α在不同类型脂肪组织中的作用和调控机制尚不清楚。因此,本研究以猪和小鼠为研究对象,探讨GADD45α与脂肪沉积的关系;进一步构建其超表达和干扰载体,并结合GADD45α敲除小鼠模型,从细胞、组织和动物整体水平研究GADD45α对不同类型脂肪细胞分化聚酯、脂肪沉积和糖脂代谢的影响及调控机制。主要研究结果如下:试验一 GADD45α与肌内脂肪沉积的关系研究本实验基于转录组数据分析,挖掘肌内脂肪沉积相关基因,发现在金华猪背最长肌中GADD45α的表达显著高于长白猪。进一步验证发现,GADD45α在高肌内脂肪含量的品种猪（金华猪、莱芜猪）肌肉中的表达显著高于肌内脂肪含量低的瘦肉型品种猪（长白猪、杜长大）。通过比较分析不同肌内脂肪含量的品种牛的基因表达谱也发现GADD45α在高肌内脂肪含量的品种牛（荷斯坦奶牛-弗利塞奶牛和赫里弗德肉牛）肌肉中的表达显著高于低肌内脂肪含量的瘦肉型品种牛（利穆赞牛）,提示GADD45α可能和牛肉大理石纹相关。GADD45α在高肌内脂肪含量的肌肉组织（腰大肌、比目鱼肌）中的表达显著高于低肌内脂肪含量的肌肉组织（背最长肌、趾伸长肌）。上述结果提示,GADD45α的表达与肌内脂肪沉积呈正相关,推测GADD45α可能影响肌内脂肪沉积。试验二GADD45α对脂肪细胞分化聚酯的影响研究为了探究GADD45α基因在脂肪沉积和代谢中的功能,本实验成功分离得到猪、小鼠肌内和皮下前体脂肪细胞以及小鼠棕色前体脂肪细胞,探究不同类型脂肪细胞分化前后的GADD45α表达规律及其与脂滴沉积的关系,并进一步构建GADD45α超表达和干扰载体,探究GADD45α对前体脂肪细胞分化聚酯的影响。结果表明,GADD45α在分化后的猪肌内和皮下脂肪细胞中表达较高;在小鼠肌内、皮下和棕色脂肪细胞中也得到相同结论。进一步研究发现,超表达GADD45α可以显著增加猪、小鼠肌内和皮下脂肪等白色脂肪细胞中的脂滴积累,促进小鼠棕色脂肪细胞内的脂肪沉积并上调脂肪合成基因Pparg、Leptin、Adipoq和Fabp4的表达;干扰GADD45α可以显著抑制猪、鼠肌内脂肪细胞和皮下脂肪细胞中的脂滴沉积,减少小鼠棕色脂肪细胞内的脂肪沉积并下调脂肪合成基因Pparg、Leptin、Adipoq和Fabp4的表达。上述结果提示,GADD45α可以正向调控肌内脂肪、皮下脂肪和棕色脂肪细胞的分化聚酯。试验三GADD45α敲除对脂肪组织发育及糖脂代谢的影响研究本实验利用Gadd45a-/-小鼠模型探究GADD45α对脂肪组织发育和糖脂代谢功能的影响。研究结果表明,GADD45α敲除显著降低了小鼠白色脂肪组织重量,对其它非脂肪组织的重量影响不大。Gadd45a-/-小鼠iWAT中脂滴较小,细胞体积变小,出现一些多室脂肪细胞;GADD45α敲除诱导白色脂肪棕色化,可显著上调iWAT中棕色化特异基因Ucpl和Cidea的表达,下调脂肪分化相关基因Pparg和Adipoq的表达;GADD45α敲除促进了 iWAT的线粒体功能及相关基因表达。同时发现,GADD45α敲除促进体内棕色脂肪细胞增殖,上调棕色脂肪组织特异性基因（Ucp1,Pgc1a和Prdm16）和线粒体标记基因（Uqcr10,Cox5b,Cox7a和Ppara）的表达;线粒体染色、透射电镜及线粒体复合物蛋白检测结果表明GADD45α敲除影响线粒体生物学功能,并通过上调UCP1和PGC1α的表达增加机体产热,提示GADD45α敲除影响棕色脂肪组织发育并促进能量代谢。葡萄糖耐受实验结果表明,Gadd45a-/-小鼠具有更好的葡糖糖耐受性;胰岛素敏感实验结果表明,Gadd45a-/-小鼠表现出更好的胰岛素敏感性。为了进一步研究GADD45α敲除对全身代谢的影响,本实验利用代谢笼测量小鼠的摄食率、能量消耗、热量生成和行为活动。结果表明,GADD45α敲除显著增加小鼠摄食量、促进小鼠的行为活动力、O2消耗率和CO2产生率,增加机体产热。高脂饲喂条件下,Gadd45a-/-小鼠和野生型小鼠的体重差别不大,但Gadd45a-/小鼠的摄食量显著高于野生型小鼠,且脂肪重量显著降低,脂肪细胞体积明显变小。在高脂饲喂条件下,Gadd45a-/-小鼠具有更好的葡糖糖耐受性和胰岛素敏感性,表明GADD45α敲除可抵抗高脂诱导的肥胖和胰岛素抵抗。上述结果提示,GADD45α敲除可以显著抑制皮下脂肪等白色脂肪组织的发育,诱导白色脂肪棕色化,促进棕色脂肪细胞增殖,促进机体糖脂代谢。试验四GADD45α调控脂肪细胞增殖及分化聚酯的分子机制研究本实验利用转录组测序、免疫荧光、免疫共沉淀、双荧光素酶报告实验和染色质沉淀等分子生物学技术,揭示了 GADD45α调控脂肪细胞增殖及分化聚酯的分子机制。利用shRNA慢病毒成功构建稳定转染的GADD45α敲除细胞系,Ki67免疫荧光染色、结晶紫染色和细胞生长检测等实验结果表明,GADD45α敲除显著促进棕色脂肪细胞增殖,GADD45α超表达显著抑制棕色脂肪细胞增殖。转录组测序结果表明GADD45α超表达后基因显著富集在细胞生长负调控、细胞周期负调控等生物学过程,下调细胞周期相关基因（Cdk5,Ccnb1,Cdkn1b,Cdkn1c,Cdkn2a,Cdkn2b,Cdkn2c和Cdk5rap2）和细胞增殖标志基因（mKi67）的表达。以上结果表明,GADD45α敲除通过上调细胞周期相关基因的表达促进棕色脂肪细胞增殖。GADD45α敲除抑制PPARy表达,GADD45α超表达促进PPARy表达,PPARγ激动剂罗格列酮可逆转GADD45α敲除对脂肪细胞分化的抑制作用。免疫共沉淀结果表明,在分化的脂肪细胞中,内源性和外源性GADD45α均与PPARγ蛋白相互作用。双荧光素酶报告实验和染色质沉淀实验进一步表明,GADD45α通过与PPARγ互作增强其转录活性,调控下游Fabp4基因的表达。上述结果提示,GADD45α调控细胞增殖的机制是通过调控细胞周期相关基因表达介导;GADD45α调控脂肪细胞分化聚酯的机制是通过与PPARγ互作并上调PPARγ的转录活性上调下游靶基因Fabp4的表达及脂肪细胞分化聚酯。综上所述,本研究通过体内、体外试验系统阐明了 GADD45α与肌内脂肪沉积的关系及其在调控脂肪细胞增殖分化及组织发育、脂质代谢和能量代谢等方面的重要功能,揭示了 GADD45α调控脂肪细胞分化聚酯的作用机制,为靶向调控脂肪沉积、调控肉品质提供一定的理论依据,同时为肥胖病等人类代谢性疾病的防治提供一定的借鉴。