论文部分内容阅读
研究目的： 丙戊酸钠（Valproate，VPA）是一种经典的抗癫痫药物，近年来VPA的其它药理作用如抗癌、治疗神经退行性变等引起了国际医学界的广泛关注。同时VPA又具有很强的致畸效应，妊娠期VPA暴露可造成胎儿神经管畸形和认知功能的障碍。因此，研究VPA的作用机制对认识癌症、神经精神疾病和出生缺陷、乃至进行有效的治疗具有重要意义。 VPA属于短链脂肪酸类组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylases inhibitors，HDACi），特异性抑制第Ⅰ类和第Ⅱa类HDAC酶活性，导致体内和体外的组蛋白高乙酰化。组蛋白的乙酰化与去乙酰化在基因表达调控、核小体组装和染色质构型重塑等过程中发挥重要的作用。表观遗传药物VPA促进包括急性髓系白血病在内的多种癌细胞分化及神经祖细胞、成骨细胞的分化和成熟过程，提示细胞命运的决定可能与HDAC抑制作用相关。与此同时，精确调控多能性干细胞的分化方向、增加干细胞分化的有效性和专一性是干细胞治疗临床应用的关键问题，故而研究VPA对干细胞多潜能性和分化的分子作用机制显得尤为重要。本研究主要目的是研究VPA对胚胎癌干细胞分化的影响并对其进行表观遗传学和转录组学分析，探讨其中可能的分子机制。 研究方法： 本研究以NCCIT、NT2/D1胚胎癌干细胞模型为研究对象，利用CCK-8法检测VPA及其它HDACi药物曲古抑菌素A（Trichostatin A，TSA）和西达本胺（Chidamide，CHI）对NCCIT、NT2/D1细胞毒性作用，筛选VPA、TSA和CHI药物作用浓度范围；通过10μM全反式维甲酸（all-trans retinoid acid，ATRA）诱导NCCIT、NT2/D1细胞向成熟体细胞分化，利用Western Blotting和实时定量PCR检测NCCIT、NT2/D1细胞经ATRA诱导后多潜能干性标志物Oct4和Sox2表达水平随时间变化的情况；利用Western Blotting和免疫荧光分别检测NT2/D1、NCCIT细胞经VPA、TSA、CHI及其分别联合ATRA处理后干性标志Oct4和Sox2表达变化；应用蛋白质组学中液相色谱-质谱联用的方法探究NCCIT细胞经1mM VPA和10nM TSA处理5天后组蛋白乙酰化修饰位点及位点丰度差异；利用Illumina Hiseq4000测序平台，对NT2/D1细胞空白对照组和1mM VPA处理组进行全转录组测序（RNA-Sequencing，RNA-Seq），将测序结果与参考基因组比对，在全转录组水平进行基因差异表达定量和差异表达基因GO、DO和KEGG通路富集分析。 研究结果： 1.细胞毒性试验结果显示，VPA、TSA和CHI对NT2/D1、NCCIT胚胎癌干细胞活性抑制呈浓度依赖的方式，且低细胞毒性作用浓度范围分别为0.25~2mM、2.5~50nM和125~1000nM。 2.Western Blotting和免疫荧光结果表明VPA和TSA、CHI等其它HDACi处理对NT2/D1、NCCIT胚胎癌干细胞向成熟体细胞分化均具有一定的促进作用，且VPA和TSA分别联合ATRA处理能进一步促进NT2/D1胚胎癌干细胞多潜能性标志的消失。 3.液相色谱-质谱连用技术鉴定分析结果发现VPA和TSA分别处理后，NCCIT胚胎癌干细胞核心组蛋白H3的N端尾部H3K23和H3K27位点乙酰化水平均高于对照组；同时，与TSA不同，VPA处理可选择性提高核心组蛋白H4的N端尾部乙酰化水平，依次为H4K16、H4K8、H4K12和H4K5位点。 4.全转录组图谱结果表明，1mM VPA处理NT2/D1细胞72h后共计影响5018个差异表达基因，其中包括2723个上调基因和2295个下调基因，GO和DO富集分析结果显示VPA作用下，NT2/D1细胞内差异表达的基因在神经发育、血管生成和成骨发育相关的通路中显著性富集，并且造成神经、肌肉、骨骼等系统相关疾病基因的表达水平改变。而KEGG通路富集分析表明，VPA处理可影响经典干细胞信号通路调控胚胎癌干细胞分化，除此之外，还可能通过影响细胞粘附和糖胺聚糖、蛋白聚糖等细胞外基质合成等途径调控胚胎癌干细胞，使其丧失多潜能性。 研究结论： 1.类似于TSA和CHI等其它HDACi，VPA对NT2/D1、NCCIT胚胎癌干细胞向成熟体细胞分化具有一定的促进作用，且联合ATRA处理能进一步促进NT2/D1胚胎癌干细胞多潜能性标志的消失。 2.相对于HDAC抑制剂TSA,VPA能选择性促进核心组蛋白H4的N端尾部H4K16、H4K8、H4K12和H4K5位点乙酰化，为深入了解VPA参与细胞命运决定的分子机制提供一定表观遗传学基础。 3.全转录组图谱结果表明，VPA可抑制经典的多潜能性维持基因，同时促进与神经发育、造血系统发育以及细胞粘附等相关的基因上调，并可能通过影响与干细胞自我更新和多潜能性相关的干细胞通路促进胚胎癌干细胞多潜能丧失。此外，VPA还可能通过细胞粘附和细胞外基质合成等途径促使其分化。