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同哺乳动物一样,鱼类细胞因子是调节鱼类先天性免疫和获得性免疫的重要免疫分子,目前已发现鱼类细胞因子大约有24种。其中,鱼类IL-6具有促进巨噬细胞和淋巴细胞增殖以及抗体合成等功能;TNF-α是一种促炎细胞因子,通过介导炎症反应,激活免疫应答来抵御病原体感染;IL-10除具有抑制炎症反应,促进损伤的组织细胞恢复外,还具有促进B细胞产生抗体等功能。因此,免疫动物血清或细胞中这三种细胞因子水平可作为衡量疫苗免疫效果的重要指标。在已报道的细胞因子检测方法中,ELISA方法具有快速、方便、特异、灵敏等优点,是最常用的检测方法。目前,国内外均已研制出哺乳动物多种细胞因子的ELISA检测试剂盒,但尚未见有鱼类细胞因子的商品化检测试剂盒。因此,建立检测草鱼细胞因子的双抗体夹心ELISA方法显得十分必要和迫切。本论文在构建草鱼三种细胞因子的克隆表达载体、制备重组gc IL-10蛋白及其抗体的基础上,建立用于检测gc IL-10的双抗体夹心ELISA方法。完成的主要研究工作和成果总结如下:1)草鱼三种细胞因子的表达载体构建与rgc IL-10制备。根据gc IL-6、gc IL-10和gc TNF-α基因序列设计三对特异性引物,以草鱼组织c DNA为模板,RT-PCR扩增目的基因并采用TA克隆方法连至p MD18-T载体。PCR鉴定结果显示扩增到大小约为645 bp(gc IL-6)、558 bp(gc IL-10)和738 bp(gc TNF-α)的三条目的基因条带;测序结果显示gc IL-6和gc TNF-α基因仅一处发生无义突变,IL-10基因无任何突变或缺失,表明三种草鱼细胞因子的克隆载体构建成功。采用酶切酶连方法将gc IL-6、gc IL-10和gc TNF-α分别亚克隆至原核表达载体p ET32a和p Creat-SII中,经PCR及双酶切鉴定发现表达载体p ET32a-gc IL-6、p ET32a-gc IL-10和p Creat-SII-gc TNF-α构建成功。重组菌p ET-32a-IL10/BL21诱导表达后的包涵体产物经变性、复性和Ni-Charged Resin亲和层析柱纯化后,获得纯度约为97%rgc IL-10蛋白,Western-blot分析rgc IL-10具有良好的免疫反应性。结果表明制备的rgc IL-10可用作后续免疫原制备和检测抗原。2)检测用多克隆抗体与酶标抗体的制备。以rgc IL-10纯化蛋白制备免疫原,分别3次免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠,制备兔抗gc IL-10抗体和鼠抗gc IL-10抗体。兔抗gc IL-10免疫血清经饱和硫酸铵分级沉淀和Protein G亲和层析后获得纯度为95%、浓度为1.7mg/m L、ELISA效价为1:838860800的兔抗gc IL-10抗体,进一步通过过碘酸钠法用辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗gc IL-10纯化抗体,经饱和硫酸铵分级沉淀后,获得纯度达到97%以上的HRP酶标兔抗gc IL-10抗体,可用作后续方法建立中的检测抗体。鼠抗gc IL-10免疫血清直接使用Protein G亲和层析法纯化后,获得纯度为95%、浓度为1.2mg/m L、ELISA效价为1:6553600的纯化抗体,可用作后续方法建立中的捕获抗体。3)草鱼IL-10双抗体夹心ELISA检测方法的建立。以鼠抗gc IL-10纯化抗体为捕获抗体,rgc IL-10纯化蛋白为检测抗原,酶标兔抗gc IL-10抗体为检测抗体,通过优化抗原、抗体的最佳工作浓度以及封闭液种类与封闭条件,建立了gc IL-10双抗体夹心ELISA检测方法。该方法的灵敏度为23.54 ng/m L,板间与板内重复试验的变异系数均小于10%,除rgc IL-10外,rgc IL-6、rgc TNF-α、m IL-10、m IFN-γ和m MCP-1等细胞因子均未检出。综上所述,本研究成功建立了草鱼白细胞介素10的双抗体夹心ELISA检测方法,该方法具有较好的特异性、灵敏度和稳定性。