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背景急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是冠心病最为凶险的类型之一,心梗后及时恢复冠脉血流是目前最有效的治疗策略。然而,心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤是阻碍其获得最佳疗效的主要制约因素之一。发生心肌I/R损伤时,引起心肌组织代谢功能紊乱,导致细胞严重受损甚至发生细胞凋亡。体内有多种机制参与调节细胞凋亡,研究表明天然免疫在心肌I/R损伤的细胞凋亡中发挥关键作用,Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)作为天然免疫应答的重要模式受体之一,其介导的信号通路参与细胞凋亡的发生发展。Pellino1是TLRs信号通路中的一个重要调控蛋白,对TLRs介导的细胞内信号转导具有重要的调控作用。已知Pellino1可以发生磷酸化、泛素化和SUMO化修饰,而且Pellino1的翻译后修饰与其E3泛素连接酶活性密切相关。但是,Pellino1 SUMO修饰对其功能有何影响,是否可以通过调控TLRs介导的细胞内信号转导参与心肌细胞凋亡的发展进程尚不明确。本研究通过突变Pellino1的SUMO修饰位点抑制其SUMO修饰,着重探讨Pellino1SUMO修饰在心肌I/R损伤诱导的心肌细胞凋亡中发挥的作用,并探讨其调控机制。目的明确Pellino1 SUMO修饰对心肌I/R诱导心肌细胞凋亡的调控作用,并初步阐明其机制是否与Pellino1 SUMO修饰调控TLRs介导的细胞内信号转导密切相关。方法1.在体动物实验通过结扎小鼠心脏的冠状动脉左前降支(left anterior descending coronary artery,LAD)45min后再灌注3d的方法构建小鼠心肌I/R损伤模型。为明确Pellino1 SUMO修饰与心肌I/R损伤的相关性,取八周龄的雄性C57/BL6小鼠随机进行试验。实验分组:假手术组(sham),缺血-再灌注组(I/R)。为进一步研究心肌细胞内Pellino1的SUMO修饰对心肌I/R损伤诱导的心肌细胞凋亡是否具有调控作用,选取八周大的雄性C57BL6小鼠在其左心耳下缘心肌点注射感染腺病毒包装的SUMO修饰位点突变的Pellino1(Adv-Peli1-5M,Pellino1的5个SUMO修饰位点突变),对照组等剂量注射对照腺病毒GFP(Adv-GFP),十天后随机进行假手术或I/R手术:假手术组(sham)、心肌I/R组(I/R)、心肌I/R+GFP腺病毒对照组(I/R+Adv-GFP)、心肌I/R+突变型Pellino1腺病毒组(I/R+Adv-Peli1-5M)。2.体外细胞实验体外培养原代乳大鼠心肌细胞。采用出生1-3d的乳大鼠提取并培养原代心肌细胞,缺氧1小时,复氧4小时建立心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤模型。通过感染腺病毒装载的Pellino1-5M(Adv-Peli1-5M)感染心肌细胞,以研究Pellino1 SUMO修饰对H/R诱导的心肌细胞凋亡的调控作用及其机制。实验分为四组:对照组(Con)、缺氧/复氧(H/R)、感染GFP腺病毒的缺氧/复氧组(Adv-GFP+H/R)、感染Adv-Peli1-5M的的缺氧/复氧组(Adv-Peli1-5M+H/R),探讨Pellino1 SUMO修饰对心肌细胞H/R损伤后细胞功能、细胞凋亡的影响及其机制。3.检测指标Western Blot和免疫共沉淀实验验证Pellino1 SUMO修饰与心肌I/R损伤相关性,检测Pellino1的E3酶活与心肌I/R损伤相关性;超声心动图检测心功能,包括左心室收缩功能,指标有射血分数(EF%)以及缩短分数(FS%)等,Evans Blue–TTC双染色评估术后心肌梗死面积的大小;TUNEL染色及Western Blot实验检测c-Caspase3(cleaved-Caspase3)、c-Caspase9(cleaved-Caspase9)、BCL-2、BAX蛋白表达水平评估缺血再灌注心肌组织细胞和缺氧复氧体外培养的原代心肌细胞的凋亡情况。结果一、心肌组织Pellino1 SUMO修饰对心肌缺血/再灌注损伤的调控作用及其机制1、心肌缺血45min再灌注3d后,心肌组织中Pellino1蛋白表达水平增加,SUMO修饰水平明显减少,提示心肌I/R损伤可能与Pellino1蛋白的SUMO修饰相关;Pellino1的E3泛素连接酶活性增加,提示心肌I/R损伤也可能与Pellino1的E3泛素连接酶活性相关。2、心肌缺血45min再灌注3d后小鼠心功能下降,Evans Blue-TTC双染色显示I/R后白色梗死灶明显。小鼠心肌局部感染Adv-Peli1-5M十天后实施心肌I/R手术,与感染对照腺病毒GFP组相比,梗死面积明显增加,射血分数和缩短分数明显降低。提示,抑制心肌组织Pellino1 SUMO修饰可增加小鼠心肌I/R损伤的严重程度。3、心肌缺血45min再灌注3d后,与对照组相比,TUNEL染色显示,局部感染SUMO修饰突变型Pellino1小鼠的心肌组织细胞凋亡数量进一步增加。表明抑制心肌组织Pellino1 SUMO修饰促进心肌I/R引起的细胞凋亡。4、心肌缺血45min再灌注3d后,心肌细胞内凋亡蛋白c-Caspase9、c-Caspase3、Bax增加,而抑凋亡蛋白BCL-2减少,当感染了突变型Pellino1抑制SUMO修饰时,上述蛋白变化进一步增加,即促凋亡蛋白进一步增加,抑凋亡蛋白进一步减少。5、心肌局部感染突变型Pellino1病毒抑制SUMO修饰,十天后实施心肌I/R手术,与感染对照病毒相比,Pellino1的E3泛素连接酶活性进一步增加,c-IAP2的泛素化修饰进一步增加。提示,抑制心肌组织Pellino1 SUMO修饰加重小鼠I/R损伤,其机制与增强Pellino1的E3泛素连接酶活性及c-IAP2的泛素化修饰相关。二、Pellino1 SUMO修饰对H/R诱导的心肌细胞凋亡的调控作用及其机制。1、构建并感染Adv-Peli1-5M腺病毒,与单纯H/R刺激组相比,Pellino1SUMO修饰水平进一步降低。2、抑制Pellino1 SUMO修饰可使心肌细胞凋亡蛋白c-Caspase3、c-Caspase9、Bax显著增加,而抑凋亡蛋白BCL-2明显减少。TUNEL染色实验显示与对照组相比,感染Adv-Peli1-5M可显著增加H/R刺激引起的心肌细胞凋亡。表明抑制Pellino1 SUMO修饰能显著增加H/R引起的心肌细胞凋亡。3、心肌细胞H/R刺激后Pellino1的E3泛素连接酶活性增加,H/R诱导心肌细胞内c-IAP2泛素化修饰增加,同时伴有TRAF3的K48位点泛素化修饰增加。抑制Pellino1 SUMO修饰可增加其E3泛素连接酶活性,且增加H/R诱导的c-IAP2泛素化修饰和TRAF3 K48泛素化修饰。4、H/R刺激后激活心肌细胞内MAPK信号通路,导致JNK、ERK、p-38磷酸化水平增加。感染Adv-Peli1-5M腺病毒使Pellino1 SUMO修饰突变高表达,明显增加H/R诱导的MAPK信号通路的激活。结论综上所述,Pellino1 SUMO修饰可能参与心肌I/R诱导的心肌细胞凋亡,并对这一病理过程发挥一定的促进作用,其机制可能与Pellino1 SUMO修饰减少后,可增强其自身E3泛素连接酶酶活性,继而激活c-IAP2/TRAF3/MAPK信号通路的调节有关。本论文研究结果有助于阐释心肌I/R损伤的分子机制,为临床防治心肌缺血再灌注损伤提供重要依据。