2007年Kitai Kim等人利用细胞松弛素D处理小鼠MⅠ期卵母细胞,抑制极体的排出后对其进行成熟培养和孤雌激活,获取二倍体染色体核型的孤雌胚胎,并从中分离得到了与治疗性克隆胚胎干细胞相类似的孤雌胚胎干细胞系(pES系),经检测这种pES系一部分与卵母细胞供体的主要组织相容性复合物(MHC)基因位点完全一致,有望成为新的比体细胞克隆胚胎干细胞更优的治疗性克隆干细胞系,用以组织细胞的替代疗法。因为取于患病动物的体细胞是一种隐含有突变基因的分化细胞,不但克隆囊胚生成率很低,而且因含有突变基因胚胎干细胞的质量也存在问题,与此相比,同样是含有杂合二倍体核型的这种新的孤雌胚胎干细胞则来源于具端粒酶活性且尚未经历个体分化途经的生殖细胞,理论上这种来源于生殖细胞的干细胞不存在当代受治疗动物的突变基因,因此这种pES系的医学应用前景更广阔,意义十分重大。在上述研究中获取含杂合二倍体孤雌囊胚比率很低,分析其原因可能与MⅠ期不成熟卵母细胞的成熟度、药物对卵母细胞的非生理性毒害作用、抑制PB1(第一极体)排出卵母细胞后体外成熟培养时间和对MⅠ期卵母细胞孤雌激活的方式等相关环节的技术不成熟有关,有待进一步的深入研究。但从以上研究可知,在PB1被抑制排出的情况下,其遗传物质具有与卵母细胞染色体同样的功能。设想排出的PB1也具有同样的功能,在人为可控的PB1排出的一小段时间内,利用核移植比较成熟的去核或不去核、移入极体方式,对新生的MⅡ期卵母细胞进行操作,然后使用精子对其进行激活,并利用精原核大于雌原核的外观特点,在分析判断雌雄原核形成发育状况的情况下,观察换核受精卵卵裂情况和移入极体去精核卵母细胞孤雌胚胎的卵裂发育情况,这项设计排除了化学物质对不成熟卯母细胞的分裂抑制和孤雌激活的非生理性毒害作用,使用可控的卵母细胞自然发育阶段,成熟的核移植技术和可观察分辨的雌雄原核发育状况及早期胚胎卵裂情况,并采用了精子激活的方式,利用已掌握的生殖规律控制卵母细胞发育的关键环节,顺其自然的促使含有PB1遗传物质二倍体染色体核型孤雌胚胎的生成,以便简化孤雌囊胚的生成途径,提高生成效率,为pES系的进一步研究奠定良好基础。本研究根据以上设计,首先对人为可控PB1排出的确切时间段和批量获取高活性PB1的简易方法进行了研究;通过卵母细胞的去核、移入极体和体外受精等方法观察PB1移入后形成雌原核的情况和受精卵裂发育情况;在此基础上将PB1移入成熟的没有去核的卵母细胞后,进行体外受精,在雌雄原核形成后去除雄原核,研究观察含有PB1杂合二倍染色体卵母细胞的孤雌发育和胚胎卵裂情况。本研究集核移植技术、体外受精技术、卵母细胞成熟培养技术、孤雌激活和核型分析技术等多种胚胎工程上游技术于一体,研究探索了含有PB1新型杂合二倍体孤雌胚胎的生成途径和影响提高其生成效率的因素。试验总结如下:1人工控制PB1排出时间研究本试验用孕马血清(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)对6-8周龄的雌性昆明系小鼠进行超数排卵处理。从注射hCG后10 h开始每隔1h取一组小鼠(每组3只小鼠),从输卵管内收集卵母细胞-卵丘细胞复合体(COCs),用适当浓度的透明质酸酶处理,脱去卵丘细胞,观察卵母细胞的数量和PB1形态,并根据本实验自制的一套极体分级图(见图3-1)进行分级,以确定刚刚排出PB1卵母细胞的最佳采集时间。结果表明:在相同的超排处理过程中,注射hCG后12h、13h和14h得到的Ⅰ、Ⅱ级PB1率较高,其中12 h最高(60.87%),且三者之间差异不显著(P＞0.05),12h与11h和14 h以后其他各组相比均差异显著(P＜0.05);15 h和16 h就Ⅰ、Ⅱ级PB1率而言差异不显著(P＞0.05)。结果显示;hCG注射后12 h所收集到的含PB1的卵母细胞,为刚刚排出极体从卵巢排出进入输卵管的新鲜卵母细胞,在进行极体重组实验时应选择此时的卵母细胞和卵母细胞中的PB1为试验材料。2有效收集高活性PB1的研究本试验采用不同浓度的链蛋白酶(1.5%、1%、0.5%)于不同作用时间对含有PB1的卵母细胞进行去除透明带处理,对分离出来的PB1采用台盼蓝染色,以筛选出适合本试验条件去除透明带分离出高活性PB1的有效方法。试验结果表明:处理组3(1%,5min)所获得的高活性PB1率均高于其他各处理组,达到了80.00%,且与其他处理组差异显著(P＜0.05);其他各组除了处理组2(0.5%,8min)和处理组5(15%,5min)差异不显著外差异均显著(P＜0.05)。因此在进行以PB1为实验材料时以1%链霉蛋白酶液处理5min进行去带处理会获得较多的高活性PB1。3新生PB1重组新生去核MⅡ期卵母细胞体外受精效果研究在注射hCG后12 h采集的含PB1的卵母细胞,采用1%链霉蛋白酶液作为去带液处理5min,获取单个高活性PB1后,在尽量短的时间内,将这一PB1重组于另一个经过物理去核处理的同期获取的卵母细胞质中,注入PB1的位置与去核的位置相同,然后对这一重组卵母细胞进行体外受精,观察其换核卵母细胞的受精情况和其后受精卵的发育情况,以验证在本实验室条件下PB1染色体组是否能够支持胚胎发育,为后面的实验奠定基础。(1)适合体外受精的重组卵母细胞体外培养时间研究将PB1移入去核卵母细胞后进行体外培养,每隔1h进行一次体外受精,比较各阶段的发育情况,以筛选出适合体外受精的最佳重组卵母细胞体外培养阶段。结果表明:PB1重组卵母细胞体外培养3h时进行体外受精的2-细胞卵裂比率最高,达到了16.67%,除与4h差异不显著(P＞0.05)外,与其他各组差异显著(P＜0.05);体外培养0h和6h都没形成2-细胞,二者之间没有差异;除了3h和4h之间差异不显著(P＞0.05)外,其他各组两两之间差异均显著(P＜0.05)。由此可知重组卵母细胞在体外成熟培养3h时,PB1的核物质能够适应成熟卵母细胞质的内环境,对融入了PB1核物质的卵母细胞进行体外受精,可以获得相对比较高的2-细胞比率。(2)重组卵母细胞体外受精后雌雄原核出现时间研究将体外成熟培养3h的重组卵母细胞放入精子获能液受精滴中孵育6h后,然后转入胚胎培养液中继续培养,每隔2h观察统计受精及其原核形成情况,记录各阶段原核胚和PB2出现的比率。结果表明:在体外受精后转入胚胎培养液培养6h雌雄原核出现PB2的比率最高,达到了22.58%,与其他各组差异均显著(P＜0.05);其他各组两两之间差异显著(P＜0.05)。由此可知,重组卵母细胞在进行体外受精后转入胚胎培养液再培养6h时,出现雌雄原核和PB2的比例最大,此时为对原核进行显微操作的最佳时期。(3)原核胚体外培养实验研究对(1)、(2)中获得的63枚原核胚进行体外培养实验。培养液分别为:①以Sigma出售的M16为基础培养液(也可按表1成分自配);②在sigrna出售(或者自配)的M16的基础上添加2.5mol/L牛磺酸、0.1mol/LEDTA.Na2、2.0mol/L谷氨酰胺等形成改良的M16(modifiedM16,mM16);③KSOM。观察原核胚体外发育结果,以探讨原核胚的体外培养条件。结果表明,只有mM16支持胚胎发育到了4-细胞,但发育率很低只有4.54%,与其他两组差异显著(P＜0.05),M16和KSOM均没有支持胚胎克服2-细胞阻滞。由此可知,在对重组卵母细胞体外受精胚进行培养时以改良的mM16为培养液比较合适。4含PB1杂合二倍体去精核卵母细胞孤雌发育研究对注射hCG后12h采集的透明带下含有PB1的卵母细胞进行荧光染色,将其排出的PB1通过显微操作直接注入原卵母细胞质紧挨卵母细胞核的位置(靠近排出PB1的位置)后进行体外培养3h,然后进行体外受精孵育6h,转入胚胎培养液中继续培养,观察雌雄原核形成情况和第二极体排出情况,对试验中形成一雄原核、两雌原核的胚胎立即进行去雄原核操作,然后对这些重构的孤雌胚进行体外培养研究。本试验旨在探讨PB1经精子激活后形成的雌原核与卵母细胞核本身形成的雌原核最后组成的二倍体是否支持孤雌胚胎的发育。结果表明:经精子激活后含有人工移入PB1的MⅡ期卵母细胞能够完成第二次减数分裂排出第二极体,出现两个雌原核和一个雄原核,人工去除雄原核后,能够形成含二倍染色体核型的重构孤雌胚胎,2-细胞率为2.32%。对所获得的2-细胞进一步培养,没有过2-细胞阻滞发育到4-细胞及以后的胚胎。结论:(1)在hCG注射后12h获得的含有PB1的卵母细胞,为刚刚排出PB1、从卵巢进入输卵管的卵母细胞,在这个时间段收集到的小鼠卵母细胞实施极体重组操作的效果最好。(2)采用1%链蛋白酶处理5min可以有效的去除卵母细胞透明带、分离获得单个高活性极体。(3)将新生PB1染色体组重组到新生MⅡ期去核卵母细胞质中,重组卵母细胞在体外培养3h再进行受精,可以获得较高的受精率(16.67%),PB1染色体组能够与精子染色体组构成受精卵的遗传物质共同支持胚胎发育。(4)经精子激活后含有人工移入PB1的MⅡ期卵母细胞能够完成第二次减数分裂排出第二极体,出现两个雌原核和一个雄原核,人工去除雄原核后,能够形成含二倍染色体核型的重构孤雌胚胎,发生卵裂的比率为2.32%。以上结论表明:本实验室所构建的含有PB1遗传物质的二倍染色体核型基因组能够支撑重构孤雌胚胎发育至2细胞期。