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摘要：目的 观察黄芪甲苷对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用的影响，并探讨其作用机理。方法 体外分离培养大鼠胚胎神经干细胞，Nestin免疫细胞化学染色进行神经干细胞的鉴定，BrdU标记鉴定增殖。采用稀释法检测黄芪甲苷高、中、低剂量组（6、0.6、0.06 ?mol/L）对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用的影响。结果 Nestin染色为阳性，BrdU的增殖鉴定为阳性。与对照组相比，黄芪甲苷高、中、低剂量组神经球生成数目明显增加。结论 黄芪甲苷能够明显增加神经球生成数目，具有促进胚胎神经干细胞体外增殖的作用。
关键词：神经干细胞；黄芪甲苷；增殖
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.05.015
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）05-0042-03
学基础[1]。近来，很多研究表明，NSCs和神经前体细胞的替代移植疗法对治疗脑和脊髓损伤、帕金森病及周围神经损伤等神经组织疾病具有强大的应用价值[2-5]。
中医药疗法在神经元保护和修复方面显示了一定作用。现代研究发现，黄芪不同提取物具有抗氧化、抗炎、扩张血管、改善脑血流等作用[6]。黄芪甲苷是从黄芪总苷中分离得到的一类单体化合物，是黄芪的主要活性成分之一。本实验采用黄芪甲苷对大鼠胚胎干细胞增殖作用进行研究，为中枢神经系统疾病和损伤的修复提供实验基础和临床应用依据。
1 实验材料
1.1 培养基、试剂与药物
HBSS液（无钙离子和镁离子，LONZA，USA）；DMEM/F12（1∶1）培养液（Hyclone Laboratories，USA）；B27添加物（GIBCO， USA）；重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，ProSpec-Tany， Isreal）；人表皮生长因子（EGF，Strathmann Biotec， Germany）；青霉素-链霉素溶液（双抗，100×，Sigma）；Nestin小鼠单克隆抗体（Santa Cruz，USA）；BrdU小鼠单克隆抗体（Sigma， Germany）；ABC试剂盒（Vector Laboratories，USA）；DAB试剂盒（Vector Laboratories，USA）；黄芪甲苷、丹酚酸B（天津中一制药）。
1.2 仪器
MCO-5M 型O2/CO2孵箱（Sanyo，Japan）；CK30倒置显微镜、IX70荧光倒置显微镜（Olympus，Japan）。
2 实验方法
2.1 神经干细胞原代培养及传代
孕16 d SD大鼠，脱臼处死，75%乙醇浸泡消毒，无菌条件下打开腹腔，取出串珠状子宫，浸泡于冷HBSS液中，取出胚胎，置于另一冷HBSS液中，小心剥离外层骨膜，取出大脑皮质并去除软脑膜，冷HBSS液漂洗2次，转移至离心管加入一定量冷HBSS，吹打呈均匀悬浊状，过200目（70 ?m）筛网，1000 r/min离心8 min，弃上清，以全培基（含2%B27，20 ?g/L bFGF，20 ?g/L EGF的DMEM/F12，1%双抗的HBSS液）重悬，约3～4个胎鼠/75 cm2的密度种入培养瓶中，37 ℃、5%CO2培养箱中培养。每2～3 d行半量换液1次。约5～9 d传代1次。传代后以1×105个/mL的密度全培基重悬种入培养瓶或培养板。
2.2 神经干细胞亚代克隆Nestin鉴定
将经过多次连续传代所形成的亚代克隆细胞球接种于预先置有50 ?g/mL多聚赖氨酸涂层盖玻片的6孔板中，贴壁生长2 h。经4%多聚甲醛固定后，0.3%Triton X-100室温通透，正常血清封闭，滴加Nestin小鼠单克隆抗体，行ABC法免疫组织化学染色。染色后，以50%甘油封片，在普通光学显微镜下观察照相。
2.3 神经干细胞BrdU标记及增殖鉴定
将NSCs亚代克隆细胞球制成1×105/mL的细胞悬液，培养3 d后掺入BrdU（10 ?mol/L），24 h后吹散NSCs克隆球，收集细胞接种于预先置有50 ?g/mL-多聚赖氨酸涂层盖玻片的6孔板中，贴壁生长2 h。经4%多聚甲醛固定后，用盐酸变性硼酸中和，然后以正常血清封闭。滴加单克隆Anti-BrdU抗体（1∶800），4 ℃过夜，行ABC法免疫组织化学染色，并以苏木素复染，以50%甘油封片，在普通光学显微镜下观察照相。
2.4 有限稀释法检测黄芪甲苷对神经干细胞的增殖作用
将NSCs克隆球制成1×105个/mL的单细胞悬液，将该细胞悬液稀释240倍，分别加入0.035 ?mol/L丹酚酸B和不同剂量的黄芪甲苷（6、0.6、0.06 ?mol/L），种入24孔板。共设5组（对照组、丹酚酸B组及黄芪甲苷高、中、低剂量组），每组4孔。常规培养4 d后对神经球进行计数（包含细胞≥5）。
3 统计学方法
采用SPSS11.5统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 神经干细胞培养及增殖鉴定
对传代NSCs进行Nestin染色，细胞胞浆呈棕黄色，为阳性（细胞阴性对照未黄染），表明本实验所培养细胞为NSCs，见图1。对传代NSCs进行BrdU标记后染色，与BrdU阴性对照比较，NSCs细胞核被黄染，表明经传代后NSCs依然具有体外分裂增殖能力，见图2。
4.2 不同剂量黄芪甲苷对神经干细胞增殖作用的影响
第1次实验结果显示，与对照组比较，黄芪甲苷高、中、低剂量组神经球生成数目均显著增加（P<0.01）。第2次实验结果显示，与对照组比较，黄芪甲苷高、中、低剂量组均能增加神经球生成数目，并且黄芪甲苷低剂量组神经球生成数目明显增加（P<0.05）。第3次实验结果显示，与对照组比较，黄芪甲苷高、中、低剂量组均能增加神经球生成数目。其中，黄芪甲苷中、低剂量组神经球生成数目明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。3次实验结果综合分析表明，黄芪甲苷可明显增加神经球生成数目，在体外具有促进NSCs增殖的作用，以中、低剂量作用更为显著。见表1。 5 讨论
NSCs源于胚胎干细胞和成年干细胞，具有自我更新、多潜能分化、低免疫原性，以及具有迁移功能等生物学特征。正常情况下NSCs通常处于静息状态，仅表现较低的再生能力，在一定的病理刺激下被激活。在神经退行性病变或中枢神经系统受到损伤的情况下，病变部位潜在的内源性干细胞可被激活，进行增殖、分化并取代死亡的神经元或胶质细胞[7]。利用NSCs治疗神经退行性病变以及修复中枢神经系统损伤存在巨大潜力。目前对NSCs的研究，一是在体外分离培养NSCs，并移植入受损的中枢神经系统内[8]；二是在体内诱导内源性NSCs的增殖和分化而获得自我修复[9-10]。由于具体的移植细胞的数量以及最佳的移植时间窗仍没有统一的标准，同时由于伦理学等因素的影响而使供体来源受限，因此寻找药物，尤其是天然植物药对内源性NSCs的增殖、分化的影响，将有巨大的价值。
Reynolds等[11-12]研究发现，可以通过NSCs形成神经球的能力来反映NSCs的自我更新能力。并且，对于神经球的培养技术已经被广泛应用，成为衡量NSCs自我更新能力的标准方法。本研究以无血清的培养基观察黄芪甲苷对神经球形成的影响。在添加EGF和bFGF的无血清培养基中，分离得到的大鼠胚胎NSCs能够增殖形成神经球。随着培养时间的延长，在含有不同浓度黄芪甲苷的药物培养基中，神经球的增殖水平有所提高。黄芪甲苷在0.06～6 ?mol/L的剂量范围内，培养板中神经球的数目显著增加。说明黄芪甲苷能够显著提高NSCs的增殖活性，并且有望在更低的剂量范围内表现出促进NSCs增殖的作用。
黄芪是常见的补气中药，有效成分主要有皂苷类、黄酮类及多糖等。曲氏等[13]研究发现，黄芪注射液使大鼠组织神经细胞的Bax蛋白表达减少，Bcl-2蛋白表达增强，抑制脑缺血再灌注损伤，发挥脑保护作用。李氏等[14]研究表明，黄芪总苷和黄芪甲苷对氢化可地松诱导老前期大鼠衰老具有延缓作用。本研究结果表明，黄芪甲苷具有明显的促进NSCs增殖作用。今后将继续对黄芪甲苷对大鼠胚胎NSCs增殖作用机制进行深入探讨和研究，为开发具有神经保护作用的药物提供依据。
参考文献：
[1] 陈文提.神经干细胞在中枢神经系统疾病治疗的研究进展[J].福建医药杂志，2007，29（2）：103-105.
[2] Bjorklund A， Lindvall O. Cell replacement therapies for central nervous system disorders[J]. Nat Neurosci，2000，3（6）：537-544.
[3] Murakami T， Fujimoto Y， Yasunaga Y， et al. Transplanted neuronal progenitor cells in a peripheral nerve gap promote nerve repair[J]. Brain Res，2003，974（1/2）：17-24.
[4] Shear DA， Tate MC， Archer DR， et al. Neural progenitor cell transplants promote long-term functional recovery after traumatic brain injury[J]. Brain Res，2004，1026（1）：11-22.
[5] Cummings BJ， Uchida N， Tamaki SJ， et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice[J]. Natl Acad Sci USA，2005，102（39）：14069- 14074.
[6] 陈春富，郭述苏，冯林，等.黄芪对大鼠脑缺血血脑屏障及脑血流的影响[J].卒中与神经疾病，1998，5（3）：132-134.
[7] Korochkin LI， Revishchin AV， Okhotin VE. Neural stem cells and their role in recovery processes in the nervous system[J]. Neuroscience and Behavioral Physiology，2006，36（5）：499-512.
[8] Freeman TB， Cicchetti F， Hauser RA， et al. Transplanted fetal striaturn in Huntington’s disease：phenotvoic development and lack of patnoioy[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2000，97（25）：13877-13882.
[9] Lee J， Seroogy KB， Mattson MP. Dietary restriction enhances neurotrophin expression and neurogenesis in the hippocampus of adult mice[J]. J Neurochem，2002，80（3）：539-547.
[10] Aberg MA， Aberg ND， Hedbacker H， et al. Peripheral infusion of IGF-1 selectively induces neurogenesis in the adult rat hippocampus[J]. J Neurosci，2000，20（8）：2896-2903.
[11] Reynolds BA， Rietze RL. Neural stem cells and neurospheres- re-evaluating the relationship[J]. Nat Meth，2005，2（5）：333-336.
[12] Reynolds BA， Welss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system[J]. Science，1992，255（5052）：1707-1710.
[13] 曲友直，赵燕玲，秦怀洲，等.黄芪注射液对脑缺血再灌注后的神经细胞凋亡及相关基因表达的影响[J].神经疾病及精神卫生，2007，7（1）：13-15.
[14] 李维祖，李卫平，尹艳艳.黄芪总苷及黄芪甲苷对糖皮质激素诱导衰老大鼠自由基代谢的影响[J].中国中药杂志，2007，32（23）：2539-2542.
（收稿日期：2012-05-11，编辑：华强）
关键词：神经干细胞；黄芪甲苷；增殖
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.05.015
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）05-0042-03
学基础[1]。近来，很多研究表明，NSCs和神经前体细胞的替代移植疗法对治疗脑和脊髓损伤、帕金森病及周围神经损伤等神经组织疾病具有强大的应用价值[2-5]。
中医药疗法在神经元保护和修复方面显示了一定作用。现代研究发现，黄芪不同提取物具有抗氧化、抗炎、扩张血管、改善脑血流等作用[6]。黄芪甲苷是从黄芪总苷中分离得到的一类单体化合物，是黄芪的主要活性成分之一。本实验采用黄芪甲苷对大鼠胚胎干细胞增殖作用进行研究，为中枢神经系统疾病和损伤的修复提供实验基础和临床应用依据。
1 实验材料
1.1 培养基、试剂与药物
HBSS液（无钙离子和镁离子，LONZA，USA）；DMEM/F12（1∶1）培养液（Hyclone Laboratories，USA）；B27添加物（GIBCO， USA）；重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，ProSpec-Tany， Isreal）；人表皮生长因子（EGF，Strathmann Biotec， Germany）；青霉素-链霉素溶液（双抗，100×，Sigma）；Nestin小鼠单克隆抗体（Santa Cruz，USA）；BrdU小鼠单克隆抗体（Sigma， Germany）；ABC试剂盒（Vector Laboratories，USA）；DAB试剂盒（Vector Laboratories，USA）；黄芪甲苷、丹酚酸B（天津中一制药）。
1.2 仪器
MCO-5M 型O2/CO2孵箱（Sanyo，Japan）；CK30倒置显微镜、IX70荧光倒置显微镜（Olympus，Japan）。
2 实验方法
2.1 神经干细胞原代培养及传代
孕16 d SD大鼠，脱臼处死，75%乙醇浸泡消毒，无菌条件下打开腹腔，取出串珠状子宫，浸泡于冷HBSS液中，取出胚胎，置于另一冷HBSS液中，小心剥离外层骨膜，取出大脑皮质并去除软脑膜，冷HBSS液漂洗2次，转移至离心管加入一定量冷HBSS，吹打呈均匀悬浊状，过200目（70 ?m）筛网，1000 r/min离心8 min，弃上清，以全培基（含2%B27，20 ?g/L bFGF，20 ?g/L EGF的DMEM/F12，1%双抗的HBSS液）重悬，约3～4个胎鼠/75 cm2的密度种入培养瓶中，37 ℃、5%CO2培养箱中培养。每2～3 d行半量换液1次。约5～9 d传代1次。传代后以1×105个/mL的密度全培基重悬种入培养瓶或培养板。
2.2 神经干细胞亚代克隆Nestin鉴定
将经过多次连续传代所形成的亚代克隆细胞球接种于预先置有50 ?g/mL多聚赖氨酸涂层盖玻片的6孔板中，贴壁生长2 h。经4%多聚甲醛固定后，0.3%Triton X-100室温通透，正常血清封闭，滴加Nestin小鼠单克隆抗体，行ABC法免疫组织化学染色。染色后，以50%甘油封片，在普通光学显微镜下观察照相。
2.3 神经干细胞BrdU标记及增殖鉴定
将NSCs亚代克隆细胞球制成1×105/mL的细胞悬液，培养3 d后掺入BrdU（10 ?mol/L），24 h后吹散NSCs克隆球，收集细胞接种于预先置有50 ?g/mL-多聚赖氨酸涂层盖玻片的6孔板中，贴壁生长2 h。经4%多聚甲醛固定后，用盐酸变性硼酸中和，然后以正常血清封闭。滴加单克隆Anti-BrdU抗体（1∶800），4 ℃过夜，行ABC法免疫组织化学染色，并以苏木素复染，以50%甘油封片，在普通光学显微镜下观察照相。
2.4 有限稀释法检测黄芪甲苷对神经干细胞的增殖作用
将NSCs克隆球制成1×105个/mL的单细胞悬液，将该细胞悬液稀释240倍，分别加入0.035 ?mol/L丹酚酸B和不同剂量的黄芪甲苷（6、0.6、0.06 ?mol/L），种入24孔板。共设5组（对照组、丹酚酸B组及黄芪甲苷高、中、低剂量组），每组4孔。常规培养4 d后对神经球进行计数（包含细胞≥5）。
3 统计学方法
采用SPSS11.5统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 神经干细胞培养及增殖鉴定
对传代NSCs进行Nestin染色，细胞胞浆呈棕黄色，为阳性（细胞阴性对照未黄染），表明本实验所培养细胞为NSCs，见图1。对传代NSCs进行BrdU标记后染色，与BrdU阴性对照比较，NSCs细胞核被黄染，表明经传代后NSCs依然具有体外分裂增殖能力，见图2。
4.2 不同剂量黄芪甲苷对神经干细胞增殖作用的影响
第1次实验结果显示，与对照组比较，黄芪甲苷高、中、低剂量组神经球生成数目均显著增加（P<0.01）。第2次实验结果显示，与对照组比较，黄芪甲苷高、中、低剂量组均能增加神经球生成数目，并且黄芪甲苷低剂量组神经球生成数目明显增加（P<0.05）。第3次实验结果显示，与对照组比较，黄芪甲苷高、中、低剂量组均能增加神经球生成数目。其中，黄芪甲苷中、低剂量组神经球生成数目明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。3次实验结果综合分析表明，黄芪甲苷可明显增加神经球生成数目，在体外具有促进NSCs增殖的作用，以中、低剂量作用更为显著。见表1。 5 讨论
NSCs源于胚胎干细胞和成年干细胞，具有自我更新、多潜能分化、低免疫原性，以及具有迁移功能等生物学特征。正常情况下NSCs通常处于静息状态，仅表现较低的再生能力，在一定的病理刺激下被激活。在神经退行性病变或中枢神经系统受到损伤的情况下，病变部位潜在的内源性干细胞可被激活，进行增殖、分化并取代死亡的神经元或胶质细胞[7]。利用NSCs治疗神经退行性病变以及修复中枢神经系统损伤存在巨大潜力。目前对NSCs的研究，一是在体外分离培养NSCs，并移植入受损的中枢神经系统内[8]；二是在体内诱导内源性NSCs的增殖和分化而获得自我修复[9-10]。由于具体的移植细胞的数量以及最佳的移植时间窗仍没有统一的标准，同时由于伦理学等因素的影响而使供体来源受限，因此寻找药物，尤其是天然植物药对内源性NSCs的增殖、分化的影响，将有巨大的价值。
Reynolds等[11-12]研究发现，可以通过NSCs形成神经球的能力来反映NSCs的自我更新能力。并且，对于神经球的培养技术已经被广泛应用，成为衡量NSCs自我更新能力的标准方法。本研究以无血清的培养基观察黄芪甲苷对神经球形成的影响。在添加EGF和bFGF的无血清培养基中，分离得到的大鼠胚胎NSCs能够增殖形成神经球。随着培养时间的延长，在含有不同浓度黄芪甲苷的药物培养基中，神经球的增殖水平有所提高。黄芪甲苷在0.06～6 ?mol/L的剂量范围内，培养板中神经球的数目显著增加。说明黄芪甲苷能够显著提高NSCs的增殖活性，并且有望在更低的剂量范围内表现出促进NSCs增殖的作用。
黄芪是常见的补气中药，有效成分主要有皂苷类、黄酮类及多糖等。曲氏等[13]研究发现，黄芪注射液使大鼠组织神经细胞的Bax蛋白表达减少，Bcl-2蛋白表达增强，抑制脑缺血再灌注损伤，发挥脑保护作用。李氏等[14]研究表明，黄芪总苷和黄芪甲苷对氢化可地松诱导老前期大鼠衰老具有延缓作用。本研究结果表明，黄芪甲苷具有明显的促进NSCs增殖作用。今后将继续对黄芪甲苷对大鼠胚胎NSCs增殖作用机制进行深入探讨和研究，为开发具有神经保护作用的药物提供依据。
参考文献：
[1] 陈文提.神经干细胞在中枢神经系统疾病治疗的研究进展[J].福建医药杂志，2007，29（2）：103-105.
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[9] Lee J， Seroogy KB， Mattson MP. Dietary restriction enhances neurotrophin expression and neurogenesis in the hippocampus of adult mice[J]. J Neurochem，2002，80（3）：539-547.
[10] Aberg MA， Aberg ND， Hedbacker H， et al. Peripheral infusion of IGF-1 selectively induces neurogenesis in the adult rat hippocampus[J]. J Neurosci，2000，20（8）：2896-2903.
[11] Reynolds BA， Rietze RL. Neural stem cells and neurospheres- re-evaluating the relationship[J]. Nat Meth，2005，2（5）：333-336.
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[13] 曲友直，赵燕玲，秦怀洲，等.黄芪注射液对脑缺血再灌注后的神经细胞凋亡及相关基因表达的影响[J].神经疾病及精神卫生，2007，7（1）：13-15.
[14] 李维祖，李卫平，尹艳艳.黄芪总苷及黄芪甲苷对糖皮质激素诱导衰老大鼠自由基代谢的影响[J].中国中药杂志，2007，32（23）：2539-2542.
（收稿日期：2012-05-11，编辑：华强）