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摘 要 目的：评估结核分支杆菌PCR、镜检对结核病诊断的价值。方法：对200例临床诊断为结核病人用PCR、镜检2种方法的阳性检出率进行比较。结果：PCR技术明显优于镜检技术，其检出率分别为64%、21%。结论：通过两种方法比较分析，说明PCR技术是一种检出率高的重要方法，对结核病的诊断有重要的参考价值。
关键词 肺结核 诊断 PCR技术 痰、结核菌
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.02.260
结核病是一种严重危害人类健康的传染病，近年来，全世界发病率呈上升趋势，我国也不例外。全国约有4亿人感染结核杆菌，其中发病人数达1000多万，每年结核病死亡人数已经超过30万。对于结核病的防治，早期诊断是重要的一环，特别是菌阴肺结核的诊断，以往采用镜检和培养的方法，存在检出率不高，周期长，价格昂贵的不足，不能切实满足临床的需要。PCR是最早建立的模拟体内DNA复制的试管内反应方式。通过2个相向的特异性引物可特异性合成所限定的特异性序列区域靶序列。经温度控制的变性、延伸和复性等数十个循环，可在数小时内百万倍增加靶序列。因此，PCR技术具有高敏感、高特异和快速性。非生长依赖性是PCR技术的优点，但也是其不能判定被检靶序列来自活或死菌的限制的原因[1]，近年来有关聚合酶链反应(PCR)技术的应用陆续报道，但有关评估PCR在临床应用价值的报告不多见，作者对收治的可疑结核病病人采用PCR技术、镜检2种方法的结果进行比较，以评估PCR技术在结核病诊断上的价值。
资料与方法
一般资料：我院2010年6月～2011年6月收治200例患者均根据临床表现、X线检查、细菌学检查及最终治疗结果明确诊断为肺结核病，其中男129例，女71例；年龄16～85岁，平均36.6岁。
材料与试剂：取患者晨痰标本，直接涂片抗酸染色镜检、PCR法检测结核杆菌。检测仪器为罗氏定量PCR监测仪(Roche Light Cycler 2.0)，试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供。
方法：将处理后样品2μl加入专用毛细管中4000rpm离心3分钟。插入圆形卡盘倒置20秒钟后放入仪器中设置循环条件：93℃→2分钟预变性，然后按93℃5秒→57℃ 45秒，做40个循环，最后置37℃延伸1秒。所有设置全部完成后保存文件，最后运行程序。反应结束后自动保存检测数据文件，调整荧光计数值为F1/F2，点击Quantification读取结果。如果Ct值=40，则实验结果为阴性。如果Ct值＜40，则实验结果为阳性。涂片以抗酸染色在镜检100个视野有3条抗酸杆菌为阳性，镜检300个视野未见抗酸杆菌为阴性。
结 果
200例患者中，痰涂片阳性42例（21.0%），PCR阳性128例（64.0%），痰涂片阴性158例中，PCR检查阳性90例（56.9%），痰涂片阳性而PCR阴性4例（9.5%）。
讨 论
结核病是青年人容易发生的一种慢性和缓发的传染病。一年四季都可以发病，15～35岁的青少年是结核病的高发峰年龄。潜伏期4～8周。其中80%发生在肺部，其他部位(颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼)也可继发感染。
本次结果显示，PCR法检测阳性率64.0%(128、200)，较痰涂片21.0%(42、200)为高，表明PCR法的敏感性优于痰涂片(P＜0.001)，适用于结核病的早期诊断，提高了结核病的阳性诊断率。文献报道肺结核患者痰标本结核菌阳性率PCR明显高于涂片和培养，尤其结核早期感染时细菌量少或化疗后细菌变异死亡难于培养时更明显[2]。PCR技术之所以快速、检出率高，关键在于它在体外用基因扩增，代替了结核分支杆菌生物培养的扩增，其特点为敏感性高，在结核杆菌仅为2条/ml的情况下能检出死菌或活菌，而痰培养只能在有生长能力的结核菌、在>10条/ml的条件下才能被检出，而痰涂片在结核菌>1000条/ml的情况下才能被检出死菌或活菌[3，4]，影响临床上对可疑肺结核病人的诊断。
本次实验显示尽管有9.5%的假阴性结果，但是在传统检验方法为阴性时PCR的检出率仍高达56.9%。
本次实验发现尽管PCR技术具有快速、敏感性高、廉价等优点，但仍然不可避免出现假阴性和假阳性反应，国内外有许多相关报道[5，6]。表明该技术还存在一定程度上的不稳定性，这可能是临床标本内抑制物引起，或从业人员操作不规范、诊断试剂不过关所致。避免上述因素发生，可减少假阳性及假阴性的产生，从而发挥PCR的优势。
结论：当代PCR技术本身已是一成熟的技术，其敏感性和特异性已无争议。PCR的高敏感性浮现出一些本来掩盖而并未得到普遍认同的结核病细菌学问题。鉴于此，我们完全可以在规范的试剂和操作基础上，将PCR技术首先应用于结核病的诊断，特别是新发涂阳结核病的诊断上。PCR技术是目前结核病初诊中最有可能成为快速的和准确的分子生物学诊断技术，我们应该学会善用它[1]。
参考文献
1 马玙,朱莉贞,潘毓萱.结核病.北京:人民卫生出版社,2006:113-114.
2 张斌,谭耀驹,谭守勇.聚合酶链反应应用于涂阳结核病早期诊断的评价.中华结核和呼吸杂志,1998,21(1):60.
3 邓为群,汪伟明,周国平,等.肺结核患者外周血白细胞中结核分支杆菌DNA检测及实验评价［J］.中国防痨杂志,1998,20(1):37-38.
4 Shankar P,Manjunath N,Mohan K K,et al.Papid diangnosis of tu2 berculosis Meninigitis by polyperase chain reaction ［J］.The lancet,1991,237(4):5-7.
5 唐神结.聚合酶链反应在结核病诊断中的应用［J］.中华结核和呼吸杂志,1992,15(2):355-357.
6 Kolk A H J.PCR assay for Mycobacterium t ubercu losis complex and other mycobacterium ［J］.Journal of Clinical Microbiology,1998,21(4):24-37.
关键词 肺结核 诊断 PCR技术 痰、结核菌
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.02.260
结核病是一种严重危害人类健康的传染病，近年来，全世界发病率呈上升趋势，我国也不例外。全国约有4亿人感染结核杆菌，其中发病人数达1000多万，每年结核病死亡人数已经超过30万。对于结核病的防治，早期诊断是重要的一环，特别是菌阴肺结核的诊断，以往采用镜检和培养的方法，存在检出率不高，周期长，价格昂贵的不足，不能切实满足临床的需要。PCR是最早建立的模拟体内DNA复制的试管内反应方式。通过2个相向的特异性引物可特异性合成所限定的特异性序列区域靶序列。经温度控制的变性、延伸和复性等数十个循环，可在数小时内百万倍增加靶序列。因此，PCR技术具有高敏感、高特异和快速性。非生长依赖性是PCR技术的优点，但也是其不能判定被检靶序列来自活或死菌的限制的原因[1]，近年来有关聚合酶链反应(PCR)技术的应用陆续报道，但有关评估PCR在临床应用价值的报告不多见，作者对收治的可疑结核病病人采用PCR技术、镜检2种方法的结果进行比较，以评估PCR技术在结核病诊断上的价值。
资料与方法
一般资料：我院2010年6月～2011年6月收治200例患者均根据临床表现、X线检查、细菌学检查及最终治疗结果明确诊断为肺结核病，其中男129例，女71例；年龄16～85岁，平均36.6岁。
材料与试剂：取患者晨痰标本，直接涂片抗酸染色镜检、PCR法检测结核杆菌。检测仪器为罗氏定量PCR监测仪(Roche Light Cycler 2.0)，试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供。
方法：将处理后样品2μl加入专用毛细管中4000rpm离心3分钟。插入圆形卡盘倒置20秒钟后放入仪器中设置循环条件：93℃→2分钟预变性，然后按93℃5秒→57℃ 45秒，做40个循环，最后置37℃延伸1秒。所有设置全部完成后保存文件，最后运行程序。反应结束后自动保存检测数据文件，调整荧光计数值为F1/F2，点击Quantification读取结果。如果Ct值=40，则实验结果为阴性。如果Ct值＜40，则实验结果为阳性。涂片以抗酸染色在镜检100个视野有3条抗酸杆菌为阳性，镜检300个视野未见抗酸杆菌为阴性。
结 果
200例患者中，痰涂片阳性42例（21.0%），PCR阳性128例（64.0%），痰涂片阴性158例中，PCR检查阳性90例（56.9%），痰涂片阳性而PCR阴性4例（9.5%）。
讨 论
结核病是青年人容易发生的一种慢性和缓发的传染病。一年四季都可以发病，15～35岁的青少年是结核病的高发峰年龄。潜伏期4～8周。其中80%发生在肺部，其他部位(颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼)也可继发感染。
本次结果显示，PCR法检测阳性率64.0%(128、200)，较痰涂片21.0%(42、200)为高，表明PCR法的敏感性优于痰涂片(P＜0.001)，适用于结核病的早期诊断，提高了结核病的阳性诊断率。文献报道肺结核患者痰标本结核菌阳性率PCR明显高于涂片和培养，尤其结核早期感染时细菌量少或化疗后细菌变异死亡难于培养时更明显[2]。PCR技术之所以快速、检出率高，关键在于它在体外用基因扩增，代替了结核分支杆菌生物培养的扩增，其特点为敏感性高，在结核杆菌仅为2条/ml的情况下能检出死菌或活菌，而痰培养只能在有生长能力的结核菌、在>10条/ml的条件下才能被检出，而痰涂片在结核菌>1000条/ml的情况下才能被检出死菌或活菌[3，4]，影响临床上对可疑肺结核病人的诊断。
本次实验显示尽管有9.5%的假阴性结果，但是在传统检验方法为阴性时PCR的检出率仍高达56.9%。
本次实验发现尽管PCR技术具有快速、敏感性高、廉价等优点，但仍然不可避免出现假阴性和假阳性反应，国内外有许多相关报道[5，6]。表明该技术还存在一定程度上的不稳定性，这可能是临床标本内抑制物引起，或从业人员操作不规范、诊断试剂不过关所致。避免上述因素发生，可减少假阳性及假阴性的产生，从而发挥PCR的优势。
结论：当代PCR技术本身已是一成熟的技术，其敏感性和特异性已无争议。PCR的高敏感性浮现出一些本来掩盖而并未得到普遍认同的结核病细菌学问题。鉴于此，我们完全可以在规范的试剂和操作基础上，将PCR技术首先应用于结核病的诊断，特别是新发涂阳结核病的诊断上。PCR技术是目前结核病初诊中最有可能成为快速的和准确的分子生物学诊断技术，我们应该学会善用它[1]。
参考文献
1 马玙,朱莉贞,潘毓萱.结核病.北京:人民卫生出版社,2006:113-114.
2 张斌,谭耀驹,谭守勇.聚合酶链反应应用于涂阳结核病早期诊断的评价.中华结核和呼吸杂志,1998,21(1):60.
3 邓为群,汪伟明,周国平,等.肺结核患者外周血白细胞中结核分支杆菌DNA检测及实验评价［J］.中国防痨杂志,1998,20(1):37-38.
4 Shankar P,Manjunath N,Mohan K K,et al.Papid diangnosis of tu2 berculosis Meninigitis by polyperase chain reaction ［J］.The lancet,1991,237(4):5-7.
5 唐神结.聚合酶链反应在结核病诊断中的应用［J］.中华结核和呼吸杂志,1992,15(2):355-357.
6 Kolk A H J.PCR assay for Mycobacterium t ubercu losis complex and other mycobacterium ［J］.Journal of Clinical Microbiology,1998,21(4):24-37.