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摘 要 目的：探讨干扰素联合拉米夫定治疗慢性乙型肝炎产生耐药后HBV发生YMDD变异及HBV膜蛋白前S2的变化。方法：应用实时荧光定量PCR检测联合应用干扰素及拉米夫定治疗慢性乙肝产生耐药后血清中HBV YMDD变异；同时应用ELISA方法检测产生耐药与未产生耐药患者的血清HBV膜蛋白前S2。结果：产生耐药后突变66例，未突变51例，野生株33例。突变66例中YIDD突变7例；YVDD突变8例；YMDD/YIDD突变12例；YMDD/YVDD突变17例，YMDD/YIDD/YVDD突变22例。产生耐药组HBV-S2阳性78例，与未产生耐药组(HBV-S2阳性32例)相比，差异有显著性(P＜0.05)。结论：产生耐药后YMDD发生突变，突变率为44%，以YMDD/YIDD/YVDD突变为主，且HBV-S2的表达增加，说明耐药后HBV病毒出现活动性复制，发生耐药机制主要为YMDD变异。
关键词 慢性乙型肝炎 干扰素 拉米夫定 YMDD变异 HBV前S2蛋白
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.02.057
Abstract Object:To study the YMDD mutation of HBV and the change of the HBVpre-S2 protein in the resistant chronic hepatitis B patients treated with interferon combined with lamivudine.Method:Real-time fluorescence quantitative PCR method was applied to detect YMDD mutation in the resistant chronic hepatitis B patients treated with interferon combined with lamivudine.ELISA was used to detect the HBV pre-S2 protein of the drug resistance group and the non-resistant group.Result:There were 66 cases with YMDD mutation after drug resistance,51 cases without mutations,33 cases with wild strains.YIDD mutation were 7 cases,YVDD 8 cases,YMDD/YIDD 12 cases,YMDD/YVDD 17 cases,YMDD/YIDD/YVDD 22 cases in 66 cases with YMDD mutation.There were 32 HBV-S2 positive cases in non-resistant group,while 78 HBV-S2 positive cases in drug resistance(P＜0.05).Conclusion:After drug resistance,YMDD mutation occurred.YMDD mutation rate was 44%,and YMDD/YIDD/YVDD was the primary type.Meanwhile,the expression of HBV-S2 increased.It was suggested that the HBV active replication had emerged again after drug resistance,and YMDD mutation was the primary pathogenesis.
Key Words Chronic Hepatitis B;Interferon;Lamivudine;YMDD mutation;HBV pre-S2 protein
慢性乙型肝炎(CHB)是一种世界广泛流行、严重危害人类健康的传染病，由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起，可发展为肝硬化、肝癌等严重肝脏疾病[1]。
慢性乙型肝炎首选核苷类抗病毒药物拉米夫定及免疫调节剂干扰素治疗已经取得了一定的效果，但单独应用疗效有限，且有一些不良反应，为提高疗效，降低耐药，现临床多采用联合用药[2]，以干扰素联合拉米夫定应用最多。拉米夫定(Lamivudine)又名贺普汀，是胞嘧啶核苷类药物，是目前公认的有效而安全的抑制病毒复制的药物，服用方便，不良反应少，易为患者接受[3]。拉米夫定作为第一个获批准的口服抗HBV药物，其问世推动了慢性乙型肝炎治疗的进程，但长期使用可诱发HBV病毒变异，引起病毒耐药，导致拉米夫定失去抑制HBV复制作用，从而逐渐产生临床常见的HBV拉米夫定耐药，并且随着用药时间的延长，耐药的几率也相应的增加[4]。干扰素(IFN)是人和动物细胞受到适宜的刺激时产生的一种具有较强生物学活性的微量蛋白，人干扰素根据其来源不同可分为α、β和γ三类，其中IFN-α由白细胞产生，它与IFN-β约有25%～30%的同源性，被统称为Ⅰ型干扰素[5]。α-干扰素(IFN-α)是慢性乙型肝炎抗病毒治疗的主要药物之一，既能抑制病毒复制，又能调节宿主免疫功能，然而仍有部分患者对IFN-α治疗疗效不满意或无应答[5]。2008年1月～2010年12月联合应用干扰素与拉米夫定治疗乙型肝炎引发YMDD变异进行检测，并分别在未耐药和耐药后对HBV-S2进行检测，探讨耐药后HBV YMDD变异情况及HBV膜蛋白前S2(HBV-S2)表达的变化，为临床检测HBV耐药及调整治疗提供实验依据。
资料与方法
一般资料：2008～2010年收治联合应用干扰素及拉米夫定进行治疗的慢性乙型肝炎患者200例，其中男108例，女92例，平均年龄45.2±20.3岁。
纳入标准：符合下列条件者纳入本研究进行结果分析：①诊断符合2000年西安会议制定的病毒性肝炎防治方案的诊断标准[6]；②无HAV、HCV、HDV、HEV、HIV重叠感染及自身免疫性肝病；③治疗开始前未用干扰素及拉米夫定进行治疗，应用干扰素及拉米夫定治疗1年后产生耐药者；④患者了解治疗全过程，掌握治疗过程中的注意事项，不随意停药。
方法：YMDD变异检测均在患者应用干扰素及拉米夫定治疗1年且产生耐药后进行，HBV-S2的检测分别在未产生耐药(服药前)和产生耐药后(服药1年后)进行。①耐药检测：采用实时荧光定量PCR法检测应用干扰素及拉米夫定治疗1年的200例慢性乙型肝炎患者HBV-DNA含量的变化，将HBV-DNA拷贝数＞104/ml的患者定为耐药组。②YMDD变异检测：采用实时荧光定量PCR法检测耐药组HBV YMDD变异情况。操作过程按照试剂盒说明步骤进行(试剂盒购自上海克隆生物科技有限公司)。循环结束后,用LightCycler软件对结果进行分析。以刚好能区分各曲线为最低标准，得到循环阈值(CT值)，根据CT值判断阴阳性。CT-c=40 HBV阴性；CT-c＜36且CT-I=40，CT-V=40，YMDD野生型；CT-c＜36且CT-I＜36，CT-V=40，YIDD突变；CT-c＜36且CT-I=40，CT-V＜36，YVDD突变；CT-c＜36且CT-I＜36，CT-V＜36，YIDD/YVDD共生突变。③HBV-S2测定：采用ELISA方法测定HBV-膜蛋白前S2(试剂由上海科华生物工程有限公司提供)。④未产生耐药组：收集诊断为慢性乙型肝炎患者入院时的血清，按照试剂盒提供的操作步骤进行操作。cut off值＞0.12为阳性。⑤耐药组：对已产生耐药的患者进行HBV-S2检测，方法同前。
统计学处理：采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。率的比较应用X.2检验；P＜0.05表示差异有统计学意义。
结 果
耐药检测结果：采用实时荧光定量PCR法检测应用干扰素及拉米夫定治疗1年的200例慢性乙型肝炎患者HBV-DNA拷贝数，将HBV-DNA拷贝数＞104/ml的患者定为耐药组，计算总体耐药率为75%，与文献报告一致[7]。结果见表1。
讨 论
乙型肝炎发病率高，全球约有3.5亿慢性HBV携带者,我国乙型肝炎病毒表面抗原阳性率为9.75%,乙型肝炎患者约3000多万。但目前尚缺乏特效的治疗方法。近年来，临床多采用联合用药，以干扰素联合拉米夫定应用最多。拉米夫定是常用的核苷类抗乙肝病毒药物,对乙肝病毒有明显抑制作用,是目前公认的有效而安全的抑制病毒复制的药物,它与乙肝病毒多聚酶结合后,竞争性抑制多聚酶活性,使HBV-DNA的链合成终止，从而有效地抑制HBV-DNA的复制[8],同时伴有ALT恢复及肝组织病理改善。长期应用拉米夫定(一般疗程>6个月以上)病毒将发生变异并导致耐药，从而使病毒复制重新活跃，甚至病情加重或死亡，其产生耐药的分子基础主要为YMDD突变为YVDD或YIDD。YMDD是HBV-DNA P基因C区内的高度保守序列，编码着HBV多聚酶基因YMDD氨基酸序列(酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸)，因此，也是拉米夫定治疗HBV的作用靶点[9]。随着拉米夫定疗程的延长，HBV-DNA发生了变异，即高度保守区的YMDD变为YVDD或YIDD。病毒的变异率随疗程的延长而升高。有文献报道16%～32%的患者用拉米夫定治疗1年后发现YMDD突变，并伴随HBV-DNA和ALT水平上升[10]。本研究检测干扰素联合拉米夫定治疗1年YMDD的变异率为44%，低于单纯拉米夫定治疗1年YMDD的变异率，与文献报道基本一致，认为干扰素可减少或延缓YMDD变异的发生[11]。另外，本研究YMDD的变异以YMDD/YIDD/YVDD变异为主，与前期研究结果一致[12]。
HBV-DNA基因组呈环状，由一个不完整的双链组成，为部分双链和可变长度的单链。目前，发现至少有6个可被转录的开放式阅读框架，即S、P、C、X以及ORF5和ORF6。S基因编码外膜蛋白，即乙型肝炎表面抗原，S基因区又分为S区，Pre S2区和Pre S1区。由3个位点相同的起始密码ATG开始分别编码226个氨基酸的S蛋白、55个氨基酸的pre-S2蛋白和108-119个氨基酸的Pre-S1蛋白[13]。Pre-S2的C端与HBsAg的N端相连，由55个氨基酸组成。Pre-S2暴露于HBV囊膜外层，具有多聚人血清白蛋白(Polymenized Human Serum Albumin，PHSA)的受体(PHSA-R)，能与PHSA结合[14～15]。由于肝细胞表面也有PHSA-R，故HBV能通过血循环中存在PHSA的介导吸附到肝细胞表面，最后经胞饮作用进入肝细胞内。Pre-S2蛋白作为HBV的包膜蛋白之一，在HBV附着和侵入肝细胞的机制中起重要作用，可作为反映HBV复制的指标之一。另据多篇报道[16～17]Pre-S2抗原与HBsAg滴度呈正相关，与HBeAg、PHSAR和HBV-DNA有良好的相关性，而且Pre-S2抗原阳性患者ALT升高的比率明显高于Pre-S2阴性的患者，二者差异有显著性，所以HBV Pre-S2抗原与病毒感染、活动性复制、转归有密切相关。综上所述，Pre-S2是判断HBV感染病毒是否活动和较大传染性的新的标志，是乙肝早期诊断、疗效观察、预后评估的一个可靠标志。本研究检测耐药后HBV前S2抗原阳性率远远大于耐药前(P＜0.05)，说明耐药后HBV病毒又出现活动性复制。
综上所述，干扰素联合拉米夫定治疗慢性乙型肝炎产生耐药后YMDD发生突变，突变率为44%，以YMDD/YIDD/YVDD突变为主，且HBV-S2的表达增加，说明耐药后HBV病毒出现活动性复制，发生耐药机制主要为YMDD变异。因此，通过慢性乙肝患者在长时期服用拉米夫定后检测HBV Pre-S2有助于判断HBV感染病毒是否活动，这样便可及时指导临床重新用药，调整治疗方案，避免延误病情。
参考文献
1 丁宁玲,朱翔,王勇平.拉米夫定联合干扰素治疗慢性乙型肝炎的疗效观察［J］.药物与临床,2010,7(28):47-48.
2 Terrault NA.Benefits and risks of combination therapy for hepatitis B［J］.Hepatology,2009,49(5 Suppl):S122-128.
3 邱源旺,黄利华,蒋祥虎.慢性乙型肝炎YMDD变异后的治疗［J］.世界华人消化杂志,2009,17(29):3034-3037.
4 商庆华,于建国,王永清.拉米夫定治疗慢性乙型肝炎YMDD耐药变异的相关因素分析［J］.实用医药杂志,2009,26(3):22-23.
5 徐丙发,范清林,魏伟,等.干扰素及长效干扰素抗肝炎病毒作用机制的研究进展［J］.中国药理学通报,2008,24(10):1276-1279.
6 中华医学会传染病与寄生虫病学分会和肝病学分会.病毒性肝炎防治方［J］.中西医结合肝病杂志,2001,11(1):56-60.
7 杨守平,胡德昌.长期拉米夫定治疗无效慢性乙肝患者106例［J］.世界华人消化杂志,2006,14(5):536-539.
关键词 慢性乙型肝炎 干扰素 拉米夫定 YMDD变异 HBV前S2蛋白
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.02.057
Abstract Object:To study the YMDD mutation of HBV and the change of the HBVpre-S2 protein in the resistant chronic hepatitis B patients treated with interferon combined with lamivudine.Method:Real-time fluorescence quantitative PCR method was applied to detect YMDD mutation in the resistant chronic hepatitis B patients treated with interferon combined with lamivudine.ELISA was used to detect the HBV pre-S2 protein of the drug resistance group and the non-resistant group.Result:There were 66 cases with YMDD mutation after drug resistance,51 cases without mutations,33 cases with wild strains.YIDD mutation were 7 cases,YVDD 8 cases,YMDD/YIDD 12 cases,YMDD/YVDD 17 cases,YMDD/YIDD/YVDD 22 cases in 66 cases with YMDD mutation.There were 32 HBV-S2 positive cases in non-resistant group,while 78 HBV-S2 positive cases in drug resistance(P＜0.05).Conclusion:After drug resistance,YMDD mutation occurred.YMDD mutation rate was 44%,and YMDD/YIDD/YVDD was the primary type.Meanwhile,the expression of HBV-S2 increased.It was suggested that the HBV active replication had emerged again after drug resistance,and YMDD mutation was the primary pathogenesis.
Key Words Chronic Hepatitis B;Interferon;Lamivudine;YMDD mutation;HBV pre-S2 protein
慢性乙型肝炎(CHB)是一种世界广泛流行、严重危害人类健康的传染病，由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起，可发展为肝硬化、肝癌等严重肝脏疾病[1]。
慢性乙型肝炎首选核苷类抗病毒药物拉米夫定及免疫调节剂干扰素治疗已经取得了一定的效果，但单独应用疗效有限，且有一些不良反应，为提高疗效，降低耐药，现临床多采用联合用药[2]，以干扰素联合拉米夫定应用最多。拉米夫定(Lamivudine)又名贺普汀，是胞嘧啶核苷类药物，是目前公认的有效而安全的抑制病毒复制的药物，服用方便，不良反应少，易为患者接受[3]。拉米夫定作为第一个获批准的口服抗HBV药物，其问世推动了慢性乙型肝炎治疗的进程，但长期使用可诱发HBV病毒变异，引起病毒耐药，导致拉米夫定失去抑制HBV复制作用，从而逐渐产生临床常见的HBV拉米夫定耐药，并且随着用药时间的延长，耐药的几率也相应的增加[4]。干扰素(IFN)是人和动物细胞受到适宜的刺激时产生的一种具有较强生物学活性的微量蛋白，人干扰素根据其来源不同可分为α、β和γ三类，其中IFN-α由白细胞产生，它与IFN-β约有25%～30%的同源性，被统称为Ⅰ型干扰素[5]。α-干扰素(IFN-α)是慢性乙型肝炎抗病毒治疗的主要药物之一，既能抑制病毒复制，又能调节宿主免疫功能，然而仍有部分患者对IFN-α治疗疗效不满意或无应答[5]。2008年1月～2010年12月联合应用干扰素与拉米夫定治疗乙型肝炎引发YMDD变异进行检测，并分别在未耐药和耐药后对HBV-S2进行检测，探讨耐药后HBV YMDD变异情况及HBV膜蛋白前S2(HBV-S2)表达的变化，为临床检测HBV耐药及调整治疗提供实验依据。
资料与方法
一般资料：2008～2010年收治联合应用干扰素及拉米夫定进行治疗的慢性乙型肝炎患者200例，其中男108例，女92例，平均年龄45.2±20.3岁。
纳入标准：符合下列条件者纳入本研究进行结果分析：①诊断符合2000年西安会议制定的病毒性肝炎防治方案的诊断标准[6]；②无HAV、HCV、HDV、HEV、HIV重叠感染及自身免疫性肝病；③治疗开始前未用干扰素及拉米夫定进行治疗，应用干扰素及拉米夫定治疗1年后产生耐药者；④患者了解治疗全过程，掌握治疗过程中的注意事项，不随意停药。
方法：YMDD变异检测均在患者应用干扰素及拉米夫定治疗1年且产生耐药后进行，HBV-S2的检测分别在未产生耐药(服药前)和产生耐药后(服药1年后)进行。①耐药检测：采用实时荧光定量PCR法检测应用干扰素及拉米夫定治疗1年的200例慢性乙型肝炎患者HBV-DNA含量的变化，将HBV-DNA拷贝数＞104/ml的患者定为耐药组。②YMDD变异检测：采用实时荧光定量PCR法检测耐药组HBV YMDD变异情况。操作过程按照试剂盒说明步骤进行(试剂盒购自上海克隆生物科技有限公司)。循环结束后,用LightCycler软件对结果进行分析。以刚好能区分各曲线为最低标准，得到循环阈值(CT值)，根据CT值判断阴阳性。CT-c=40 HBV阴性；CT-c＜36且CT-I=40，CT-V=40，YMDD野生型；CT-c＜36且CT-I＜36，CT-V=40，YIDD突变；CT-c＜36且CT-I=40，CT-V＜36，YVDD突变；CT-c＜36且CT-I＜36，CT-V＜36，YIDD/YVDD共生突变。③HBV-S2测定：采用ELISA方法测定HBV-膜蛋白前S2(试剂由上海科华生物工程有限公司提供)。④未产生耐药组：收集诊断为慢性乙型肝炎患者入院时的血清，按照试剂盒提供的操作步骤进行操作。cut off值＞0.12为阳性。⑤耐药组：对已产生耐药的患者进行HBV-S2检测，方法同前。
统计学处理：采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。率的比较应用X.2检验；P＜0.05表示差异有统计学意义。
结 果
耐药检测结果：采用实时荧光定量PCR法检测应用干扰素及拉米夫定治疗1年的200例慢性乙型肝炎患者HBV-DNA拷贝数，将HBV-DNA拷贝数＞104/ml的患者定为耐药组，计算总体耐药率为75%，与文献报告一致[7]。结果见表1。
讨 论
乙型肝炎发病率高，全球约有3.5亿慢性HBV携带者,我国乙型肝炎病毒表面抗原阳性率为9.75%,乙型肝炎患者约3000多万。但目前尚缺乏特效的治疗方法。近年来，临床多采用联合用药，以干扰素联合拉米夫定应用最多。拉米夫定是常用的核苷类抗乙肝病毒药物,对乙肝病毒有明显抑制作用,是目前公认的有效而安全的抑制病毒复制的药物,它与乙肝病毒多聚酶结合后,竞争性抑制多聚酶活性,使HBV-DNA的链合成终止，从而有效地抑制HBV-DNA的复制[8],同时伴有ALT恢复及肝组织病理改善。长期应用拉米夫定(一般疗程>6个月以上)病毒将发生变异并导致耐药，从而使病毒复制重新活跃，甚至病情加重或死亡，其产生耐药的分子基础主要为YMDD突变为YVDD或YIDD。YMDD是HBV-DNA P基因C区内的高度保守序列，编码着HBV多聚酶基因YMDD氨基酸序列(酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸)，因此，也是拉米夫定治疗HBV的作用靶点[9]。随着拉米夫定疗程的延长，HBV-DNA发生了变异，即高度保守区的YMDD变为YVDD或YIDD。病毒的变异率随疗程的延长而升高。有文献报道16%～32%的患者用拉米夫定治疗1年后发现YMDD突变，并伴随HBV-DNA和ALT水平上升[10]。本研究检测干扰素联合拉米夫定治疗1年YMDD的变异率为44%，低于单纯拉米夫定治疗1年YMDD的变异率，与文献报道基本一致，认为干扰素可减少或延缓YMDD变异的发生[11]。另外，本研究YMDD的变异以YMDD/YIDD/YVDD变异为主，与前期研究结果一致[12]。
HBV-DNA基因组呈环状，由一个不完整的双链组成，为部分双链和可变长度的单链。目前，发现至少有6个可被转录的开放式阅读框架，即S、P、C、X以及ORF5和ORF6。S基因编码外膜蛋白，即乙型肝炎表面抗原，S基因区又分为S区，Pre S2区和Pre S1区。由3个位点相同的起始密码ATG开始分别编码226个氨基酸的S蛋白、55个氨基酸的pre-S2蛋白和108-119个氨基酸的Pre-S1蛋白[13]。Pre-S2的C端与HBsAg的N端相连，由55个氨基酸组成。Pre-S2暴露于HBV囊膜外层，具有多聚人血清白蛋白(Polymenized Human Serum Albumin，PHSA)的受体(PHSA-R)，能与PHSA结合[14～15]。由于肝细胞表面也有PHSA-R，故HBV能通过血循环中存在PHSA的介导吸附到肝细胞表面，最后经胞饮作用进入肝细胞内。Pre-S2蛋白作为HBV的包膜蛋白之一，在HBV附着和侵入肝细胞的机制中起重要作用，可作为反映HBV复制的指标之一。另据多篇报道[16～17]Pre-S2抗原与HBsAg滴度呈正相关，与HBeAg、PHSAR和HBV-DNA有良好的相关性，而且Pre-S2抗原阳性患者ALT升高的比率明显高于Pre-S2阴性的患者，二者差异有显著性，所以HBV Pre-S2抗原与病毒感染、活动性复制、转归有密切相关。综上所述，Pre-S2是判断HBV感染病毒是否活动和较大传染性的新的标志，是乙肝早期诊断、疗效观察、预后评估的一个可靠标志。本研究检测耐药后HBV前S2抗原阳性率远远大于耐药前(P＜0.05)，说明耐药后HBV病毒又出现活动性复制。
综上所述，干扰素联合拉米夫定治疗慢性乙型肝炎产生耐药后YMDD发生突变，突变率为44%，以YMDD/YIDD/YVDD突变为主，且HBV-S2的表达增加，说明耐药后HBV病毒出现活动性复制，发生耐药机制主要为YMDD变异。因此，通过慢性乙肝患者在长时期服用拉米夫定后检测HBV Pre-S2有助于判断HBV感染病毒是否活动，这样便可及时指导临床重新用药，调整治疗方案，避免延误病情。
参考文献
1 丁宁玲,朱翔,王勇平.拉米夫定联合干扰素治疗慢性乙型肝炎的疗效观察［J］.药物与临床,2010,7(28):47-48.
2 Terrault NA.Benefits and risks of combination therapy for hepatitis B［J］.Hepatology,2009,49(5 Suppl):S122-128.
3 邱源旺,黄利华,蒋祥虎.慢性乙型肝炎YMDD变异后的治疗［J］.世界华人消化杂志,2009,17(29):3034-3037.
4 商庆华,于建国,王永清.拉米夫定治疗慢性乙型肝炎YMDD耐药变异的相关因素分析［J］.实用医药杂志,2009,26(3):22-23.
5 徐丙发,范清林,魏伟,等.干扰素及长效干扰素抗肝炎病毒作用机制的研究进展［J］.中国药理学通报,2008,24(10):1276-1279.
6 中华医学会传染病与寄生虫病学分会和肝病学分会.病毒性肝炎防治方［J］.中西医结合肝病杂志,2001,11(1):56-60.
7 杨守平,胡德昌.长期拉米夫定治疗无效慢性乙肝患者106例［J］.世界华人消化杂志,2006,14(5):536-539.