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摘要[目的]筛选马铃薯疮痂病的生防菌。[方法]从马铃薯疮痂病发病土壤中取样，经过稀释培养和二次划线纯化获得单克隆菌株，通过抑菌试验最终得到1株对马铃薯疮痂病具有较好抑制效果的细菌BU09，通过16S rDNA测序和系统进化分析对该菌株进行分子鉴定。[结果]细菌BU09属于普城沙雷氏菌，对马铃薯疮痂病具有较好的防治效果。[结论]试验结果为马铃薯疮痂病的田间防治提供了参考。
关键词马铃薯疮痂病；疮痂链霉菌；普城沙雷氏菌；生物防治
中图分类号S435.32文献标识码A文章编号0517-6611（2017）11-0123-02
Abstract[Objective] To screen out biocontrol bacteria for potato scab.[Method] We sampled from the potato scab diseased soil， and screened single clone strains by dilution and streak culture. A strain named BU09 which had obvious effect against S. scabies was gained by inhibition zone test. The molecular identification was executed through 16S rDNA sequencing and phylogenetic analysis.[Result] The BU09 strain was classified as Serratia plymuthica. The following pot trail revealed that BU09 had a good inhibition effect against S. scabies.[Conclusion] This result can supply reference for the filed control against potato scab.
Key wordsPotato scab；Scab streptomyces；Serratia plymuthica；Biocontrol
马铃薯疮痂病是由植物病原菌链霉菌（Steptomyces spp.）引起的，只侵害马铃薯的地下块茎部。最初在块茎上出现褐色斑点，后逐渐扩大形成圆形病斑，病斑周缘突起，周围有一圈皱缩木栓层，最后形成疮痂状硬斑。该病害不仅会造成马铃薯产量降低，更会严重影响马铃薯的外观品质，极大地降低马铃薯的商业价值[1-2]。疮痂病原菌链霉菌属放线菌，可在土壤中存活多年，营腐生生活，有好气性，最适生长与发病温度为25 ℃[3-5]。黑龙江省地处北温带与寒带交叉带，土壤温度在马铃薯生长期长时间维持在25 ℃左右，为马铃薯疮痂病的发生和流行提供了机会。目前，在黑龙江省各马铃薯种植区已经发现了多处疮痂病发生的种植区，呈现出了大规模暴发的态势，值得引起足够的重视，需及早进行防控，避免造成更大规模的损失。
马铃薯疮痂病是一种难防的世界性土传病害，目前对该病害还缺乏特别有效的防治方法，生产中针对该病害的主要防治方法有选用抗病品种、化学药剂防治和生物制剂防治等[6-8]。其中，抗病品种具有筛选难度大、适用地区受限的缺点；而化学药剂不仅污染环境，还会使土壤的微生物生态系统失衡，不利于可持续发展。研究表明，采用生物防治手段抑制馬铃薯疮痂病是较有效的方法[9-12]。马铃薯疮痂病在自然条件下发病的严重程度主要取决于土壤中病原菌的数量和种类，同时土壤中还会相应存在对其具有拮抗性的微生物。这些拮抗菌株可产生抑制病原菌生长的物质，且可自然分解、无有害物质残留，因此被广泛关注。在黑龙江省马铃薯种植面积快速增加的背景下，马铃薯疮痂病暴发的潜在危险值得引起重视，针对马铃薯疮痂病害的生物防治研究应尽快开展。笔者针对以上情况，从马铃薯疮痂病害发生地区采集发病土壤和块茎组织，进行了拮抗菌的筛选和鉴定，获得具有突出抑制效果的生防菌，随后进行盆栽试验，测定了生防菌对疮痂链霉菌的防治效果，以期为疮痂链霉菌的防治提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1培养基。YME固体平板：酵母粉 4 g，麦芽糖提取物 10 g，葡萄糖右旋糖 4 g，琼脂粉 15 g，蒸馏水定容至1 L，pH 7.2，121 ℃下湿热灭菌30 min，冷却后倒入培养皿。LB固体平板：蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，琼脂粉 15 g，蒸馏水定容至1 L，pH 7.0，121 ℃下湿热灭菌30 min，冷却后倒入培养皿。
1.1.2供试菌种。马铃薯疮痂链霉菌（S.scabies）为黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院保存，测试马铃薯品种为大西洋。
1.1.3试剂。Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR Buffer购自MBI；PCR产物纯化试剂盒、T载体试剂盒购自天根生化公司。引物合成、测序由生工生物公司完成。
1.2方法
1.2.1目的菌株的筛选。从黑龙江省克山县马铃薯种植区疮痂病发病地块中取土样，称取1 g，加入含有玻璃珠的200 mL三角瓶中，加蒸馏水50 mL，150 r/min振荡1 h。取悬浮培养液稀释10-2后，取100 μL涂布到LB固体平板上，37 ℃倒置静止培养24 h，得到布满单克隆的平板。选取不同外观的克隆分别进行划线培养，得到纯培养菌株，编号并溶解到20%甘油的溶液中，于-80 ℃保存。目的菌株的抑菌效果测试采用抑菌圈法。将疮痂链霉菌制作成菌悬液，取100 μL涂布到YME固体平板上，取5 μL上述待测试菌株冻存液接种到涂有疮痂链霉菌的YME平板上，28 ℃倒置静止培养5 d，根据所产生的抑菌圈大小来判断抑菌效果。 1.2.2目的菌株的鉴定。为了所获得的生防菌株进行分子鉴定，使用细菌16S rDNA 通用引物对该菌株进行PCR扩增，引物为：27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）。PCR扩增条件：95 ℃预变性 6 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物通过PCR产物纯化试剂盒进行纯化，取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳测定浓度后，使用T载体试剂盒将PCR产物连接至T载体中，转化DH5α感受态细胞，PCR鉴定阳性克隆后送交生工生物测序。将该菌株的16S rDNA基因序列利用NCBI Blast数据库进行同源性分析，使用MEGA软件构建系统发育树。
1.2.3盆栽试验法测定生防菌的防治效果。选取健康的马铃薯块茎，表面用70%乙醇消毒，然后用清水冲洗干净，放置在 28 ℃光照培养箱中催芽。待出芽后将马铃薯块茎切成留有1个芽眼的三角块，选取芽长相近的薯块播至花盆（直径25 cm）中，在温室中培养，待薯苗长出后，选取长势一致的植株进行试验。将疮痂链霉菌制成 1×107 CFU/mL的菌悬液，采用灌根法接种，每盆加入10 mL，7 d后接入生防菌菌悬液（1×107 CFU/mL），CK为对照，不加生防菌；处理1为每盆10 mL生防菌，处理2为每盆20 mL生防菌。每个处理重复5次。待马铃薯收获后进行病害分級鉴定，并计算病情指数和防治效果。
2结果与分析
2.1目的菌株的获得从马铃薯疮痂病发病土壤中取样，经过稀释涂板和二次划线分离后，得到500余株单克隆菌株。进而通过抑菌圈法检测菌株对链霉菌的抑制效果，得到多株对链霉菌具有抑制效果的菌株。其中，编号为BU09号的菌株效果较好（图1）。
2.2目的菌株的鉴定通过对该菌株的16S rDNA序列进行PCR扩增、连接至T载体，送交测序后，得到该菌株的16S rDNA序列，经NCBI Blast比对，选取相似序列菌株通过Mega5软件系统进化分析（图2），发现该菌株的16S rDNA序列与普城沙雷氏菌具有99%的同源性，因此确定该菌株为普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica）。
2.3BU09菌株对疮痂链霉菌的防治效果BU09菌株对疮痂链霉菌的盆栽试验结果显示，对照处理中马铃薯疮痂病发病较严重，每个块茎表面均有多个病斑；处理1中马铃薯疮痂病发病较轻，每个块茎表面有1～2个病斑；处理2中马铃薯疮痂病发病不明显，块茎表面未发现明显病斑（图3）。
3结论与讨论
普城沙雷氏菌是革兰氏阴性菌，1987年首次在植物病害的生物防治上得到应用。近些年，在防治Verticllium dahliae、Sclerotinia sclerotiorum、Rhizoctonia solani、Botrytis cinerea、Phythium spp.等方面研究报道很多[13]。如Serratia plymuthica A21-4[14]是从洋葱根际土壤中筛选出的1株对辣椒疫霉有强烈拮抗能力的菌，对辣椒疫霉菌的菌丝生长、游动孢子囊和游动孢子的形成、萌发有着强烈的抑制作用；Serratia plymuthica HRO-C48[15]是从油菜根际分离出的1株产几丁质酶和IAA的植物根际促生细菌，可抑制真菌生长，对黄瓜
猝倒病、番茄灰霉病具有防治效果。
普城沙雷氏菌BU09对马铃薯疮痂病具有较明显的防治效果，是首次关于普城沙雷氏菌对链霉菌具有防治效果的研究报道。此外，经初步研究发现BU09的主要抑菌成分存在于培养液上清中，且为脂溶性化合物。因此，该菌抑菌成分的鉴定需要进一步研究确认。该研究分离得到的BU09不仅在培养基上对疮痂链霉菌具有抑制效果，还可以在土壤种植试验中起到明显的抑菌效果，可以进一步开发为生防菌制剂，为马铃薯疮痂病的防治提供参考。
参考文献
[1] LOCCI R.Actinomycetes as plant pathogens[J].European journal of plant pathology，1994，100（3）：179-200.
[2] 赵伟全，杨文香，刘大群，等.中国马铃薯疮痂病研究初报[J].河北农业大学学报，2004，27（6）：74-77.
[3] LORIA R，KEMPTER B A.Relative resistance of potato tubers produced from stem cuttings and seedpiecepropagated plants to Streptomyces scabies[J].Plant disease，1986，70（12）：1146-1148.
[4] GOYER C，OTRYSKO B，BEAULIEU C.Taxonomic studies on streptomycetes causing potato common scab：A review[J].Canadian journal of plant pathology，1996，18（2）：107-113.
[5] KING R R，LAWRENCE C H，CLARK M C.Correlation of phytotoxin production with pathogenicity of Streptomyces scabies isolates from scab infected potato tubers[J].American journal of potato research，1991，68（10）：675-680.
[6] HILTUNEN L H，LAAKSO I，CHOBOT V，et al.Influence of thaxtomins in different combinations and concentrations on growth of micropropagated potato shoot cultures[J].Journal of agricultural and food chemistry，2006，54（9）：3372-3379. [7] BEAUSJOUR J，CLERMONT N，BEAULIEU C.Effect of Streptomyces melanosporofaciens strain EF76 and of chitosan on common scab of potato[J].Plant and soil，2003，256（2）：463-468.
[8] NEENOECKWALL E C，KINKEL L L，SCHOTTEL J L.Competition and antibiosis in the biological control of potato scab[J].Canadian journal of microbiology，2001，47（4）：332-340.
[9] SCHOTTEL J L，SHIMIZU K，KINKEL L L.Relationships of in vitro pathogen inhibition and soil colonization to potato scab biocontrol by antagonistic Streptomyces spp.[J]. Biological control，2001，20（2）：102-112.
[10] AGBESSI S，BEAUSJOUR J，DRY C，et al.Antagonistic properties of two recombinant strains of Streptomyces melanosporofaciens obtained by intraspecific protoplast fusion[J].Applied microbiol biotechnol，2003，62（2）：233-238.
[11] HAN J S，CHENG J H，YOON T M，et al.Biological control agent of common scab disease by antagonistic strain Bacillus sp.sunhua[J].Journal of applied microbiology，2005，99（1）：213-221.
[12] 劉大群，ANDERSON N A，KINKEL L L.拮抗链霉菌防治马铃薯疮痂病的大田试验研究[J].植物病理学报，2000，30（3）：237-244.
[13] BERG G.Diversity of antifungal and plantassociated Serratia plymuthica strains[J].Journal of applied microbiology，2000，88（6）：952-960.
[14] SHEN S S，CHOI O H，PARK S H，et al.Root colonizing and biocontrol competency of Serratia plymuthica A214 against phytophthora blight of pepper[J].The plant pathology journal，2005，21（1）：64-67.
[15] 马迎新，刘晓光，高光祥，等.根际细菌Serratia plymuthica HROC48的生防作用初探[J].云南农业大学学报，2007，22（1）：49-53.
关键词马铃薯疮痂病；疮痂链霉菌；普城沙雷氏菌；生物防治
中图分类号S435.32文献标识码A文章编号0517-6611（2017）11-0123-02
Abstract[Objective] To screen out biocontrol bacteria for potato scab.[Method] We sampled from the potato scab diseased soil， and screened single clone strains by dilution and streak culture. A strain named BU09 which had obvious effect against S. scabies was gained by inhibition zone test. The molecular identification was executed through 16S rDNA sequencing and phylogenetic analysis.[Result] The BU09 strain was classified as Serratia plymuthica. The following pot trail revealed that BU09 had a good inhibition effect against S. scabies.[Conclusion] This result can supply reference for the filed control against potato scab.
Key wordsPotato scab；Scab streptomyces；Serratia plymuthica；Biocontrol
马铃薯疮痂病是由植物病原菌链霉菌（Steptomyces spp.）引起的，只侵害马铃薯的地下块茎部。最初在块茎上出现褐色斑点，后逐渐扩大形成圆形病斑，病斑周缘突起，周围有一圈皱缩木栓层，最后形成疮痂状硬斑。该病害不仅会造成马铃薯产量降低，更会严重影响马铃薯的外观品质，极大地降低马铃薯的商业价值[1-2]。疮痂病原菌链霉菌属放线菌，可在土壤中存活多年，营腐生生活，有好气性，最适生长与发病温度为25 ℃[3-5]。黑龙江省地处北温带与寒带交叉带，土壤温度在马铃薯生长期长时间维持在25 ℃左右，为马铃薯疮痂病的发生和流行提供了机会。目前，在黑龙江省各马铃薯种植区已经发现了多处疮痂病发生的种植区，呈现出了大规模暴发的态势，值得引起足够的重视，需及早进行防控，避免造成更大规模的损失。
马铃薯疮痂病是一种难防的世界性土传病害，目前对该病害还缺乏特别有效的防治方法，生产中针对该病害的主要防治方法有选用抗病品种、化学药剂防治和生物制剂防治等[6-8]。其中，抗病品种具有筛选难度大、适用地区受限的缺点；而化学药剂不仅污染环境，还会使土壤的微生物生态系统失衡，不利于可持续发展。研究表明，采用生物防治手段抑制馬铃薯疮痂病是较有效的方法[9-12]。马铃薯疮痂病在自然条件下发病的严重程度主要取决于土壤中病原菌的数量和种类，同时土壤中还会相应存在对其具有拮抗性的微生物。这些拮抗菌株可产生抑制病原菌生长的物质，且可自然分解、无有害物质残留，因此被广泛关注。在黑龙江省马铃薯种植面积快速增加的背景下，马铃薯疮痂病暴发的潜在危险值得引起重视，针对马铃薯疮痂病害的生物防治研究应尽快开展。笔者针对以上情况，从马铃薯疮痂病害发生地区采集发病土壤和块茎组织，进行了拮抗菌的筛选和鉴定，获得具有突出抑制效果的生防菌，随后进行盆栽试验，测定了生防菌对疮痂链霉菌的防治效果，以期为疮痂链霉菌的防治提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1培养基。YME固体平板：酵母粉 4 g，麦芽糖提取物 10 g，葡萄糖右旋糖 4 g，琼脂粉 15 g，蒸馏水定容至1 L，pH 7.2，121 ℃下湿热灭菌30 min，冷却后倒入培养皿。LB固体平板：蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，琼脂粉 15 g，蒸馏水定容至1 L，pH 7.0，121 ℃下湿热灭菌30 min，冷却后倒入培养皿。
1.1.2供试菌种。马铃薯疮痂链霉菌（S.scabies）为黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院保存，测试马铃薯品种为大西洋。
1.1.3试剂。Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR Buffer购自MBI；PCR产物纯化试剂盒、T载体试剂盒购自天根生化公司。引物合成、测序由生工生物公司完成。
1.2方法
1.2.1目的菌株的筛选。从黑龙江省克山县马铃薯种植区疮痂病发病地块中取土样，称取1 g，加入含有玻璃珠的200 mL三角瓶中，加蒸馏水50 mL，150 r/min振荡1 h。取悬浮培养液稀释10-2后，取100 μL涂布到LB固体平板上，37 ℃倒置静止培养24 h，得到布满单克隆的平板。选取不同外观的克隆分别进行划线培养，得到纯培养菌株，编号并溶解到20%甘油的溶液中，于-80 ℃保存。目的菌株的抑菌效果测试采用抑菌圈法。将疮痂链霉菌制作成菌悬液，取100 μL涂布到YME固体平板上，取5 μL上述待测试菌株冻存液接种到涂有疮痂链霉菌的YME平板上，28 ℃倒置静止培养5 d，根据所产生的抑菌圈大小来判断抑菌效果。 1.2.2目的菌株的鉴定。为了所获得的生防菌株进行分子鉴定，使用细菌16S rDNA 通用引物对该菌株进行PCR扩增，引物为：27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）。PCR扩增条件：95 ℃预变性 6 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物通过PCR产物纯化试剂盒进行纯化，取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳测定浓度后，使用T载体试剂盒将PCR产物连接至T载体中，转化DH5α感受态细胞，PCR鉴定阳性克隆后送交生工生物测序。将该菌株的16S rDNA基因序列利用NCBI Blast数据库进行同源性分析，使用MEGA软件构建系统发育树。
1.2.3盆栽试验法测定生防菌的防治效果。选取健康的马铃薯块茎，表面用70%乙醇消毒，然后用清水冲洗干净，放置在 28 ℃光照培养箱中催芽。待出芽后将马铃薯块茎切成留有1个芽眼的三角块，选取芽长相近的薯块播至花盆（直径25 cm）中，在温室中培养，待薯苗长出后，选取长势一致的植株进行试验。将疮痂链霉菌制成 1×107 CFU/mL的菌悬液，采用灌根法接种，每盆加入10 mL，7 d后接入生防菌菌悬液（1×107 CFU/mL），CK为对照，不加生防菌；处理1为每盆10 mL生防菌，处理2为每盆20 mL生防菌。每个处理重复5次。待马铃薯收获后进行病害分級鉴定，并计算病情指数和防治效果。
2结果与分析
2.1目的菌株的获得从马铃薯疮痂病发病土壤中取样，经过稀释涂板和二次划线分离后，得到500余株单克隆菌株。进而通过抑菌圈法检测菌株对链霉菌的抑制效果，得到多株对链霉菌具有抑制效果的菌株。其中，编号为BU09号的菌株效果较好（图1）。
2.2目的菌株的鉴定通过对该菌株的16S rDNA序列进行PCR扩增、连接至T载体，送交测序后，得到该菌株的16S rDNA序列，经NCBI Blast比对，选取相似序列菌株通过Mega5软件系统进化分析（图2），发现该菌株的16S rDNA序列与普城沙雷氏菌具有99%的同源性，因此确定该菌株为普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica）。
2.3BU09菌株对疮痂链霉菌的防治效果BU09菌株对疮痂链霉菌的盆栽试验结果显示，对照处理中马铃薯疮痂病发病较严重，每个块茎表面均有多个病斑；处理1中马铃薯疮痂病发病较轻，每个块茎表面有1～2个病斑；处理2中马铃薯疮痂病发病不明显，块茎表面未发现明显病斑（图3）。
3结论与讨论
普城沙雷氏菌是革兰氏阴性菌，1987年首次在植物病害的生物防治上得到应用。近些年，在防治Verticllium dahliae、Sclerotinia sclerotiorum、Rhizoctonia solani、Botrytis cinerea、Phythium spp.等方面研究报道很多[13]。如Serratia plymuthica A21-4[14]是从洋葱根际土壤中筛选出的1株对辣椒疫霉有强烈拮抗能力的菌，对辣椒疫霉菌的菌丝生长、游动孢子囊和游动孢子的形成、萌发有着强烈的抑制作用；Serratia plymuthica HRO-C48[15]是从油菜根际分离出的1株产几丁质酶和IAA的植物根际促生细菌，可抑制真菌生长，对黄瓜
猝倒病、番茄灰霉病具有防治效果。
普城沙雷氏菌BU09对马铃薯疮痂病具有较明显的防治效果，是首次关于普城沙雷氏菌对链霉菌具有防治效果的研究报道。此外，经初步研究发现BU09的主要抑菌成分存在于培养液上清中，且为脂溶性化合物。因此，该菌抑菌成分的鉴定需要进一步研究确认。该研究分离得到的BU09不仅在培养基上对疮痂链霉菌具有抑制效果，还可以在土壤种植试验中起到明显的抑菌效果，可以进一步开发为生防菌制剂，为马铃薯疮痂病的防治提供参考。
参考文献
[1] LOCCI R.Actinomycetes as plant pathogens[J].European journal of plant pathology，1994，100（3）：179-200.
[2] 赵伟全，杨文香，刘大群，等.中国马铃薯疮痂病研究初报[J].河北农业大学学报，2004，27（6）：74-77.
[3] LORIA R，KEMPTER B A.Relative resistance of potato tubers produced from stem cuttings and seedpiecepropagated plants to Streptomyces scabies[J].Plant disease，1986，70（12）：1146-1148.
[4] GOYER C，OTRYSKO B，BEAULIEU C.Taxonomic studies on streptomycetes causing potato common scab：A review[J].Canadian journal of plant pathology，1996，18（2）：107-113.
[5] KING R R，LAWRENCE C H，CLARK M C.Correlation of phytotoxin production with pathogenicity of Streptomyces scabies isolates from scab infected potato tubers[J].American journal of potato research，1991，68（10）：675-680.
[6] HILTUNEN L H，LAAKSO I，CHOBOT V，et al.Influence of thaxtomins in different combinations and concentrations on growth of micropropagated potato shoot cultures[J].Journal of agricultural and food chemistry，2006，54（9）：3372-3379. [7] BEAUSJOUR J，CLERMONT N，BEAULIEU C.Effect of Streptomyces melanosporofaciens strain EF76 and of chitosan on common scab of potato[J].Plant and soil，2003，256（2）：463-468.
[8] NEENOECKWALL E C，KINKEL L L，SCHOTTEL J L.Competition and antibiosis in the biological control of potato scab[J].Canadian journal of microbiology，2001，47（4）：332-340.
[9] SCHOTTEL J L，SHIMIZU K，KINKEL L L.Relationships of in vitro pathogen inhibition and soil colonization to potato scab biocontrol by antagonistic Streptomyces spp.[J]. Biological control，2001，20（2）：102-112.
[10] AGBESSI S，BEAUSJOUR J，DRY C，et al.Antagonistic properties of two recombinant strains of Streptomyces melanosporofaciens obtained by intraspecific protoplast fusion[J].Applied microbiol biotechnol，2003，62（2）：233-238.
[11] HAN J S，CHENG J H，YOON T M，et al.Biological control agent of common scab disease by antagonistic strain Bacillus sp.sunhua[J].Journal of applied microbiology，2005，99（1）：213-221.
[12] 劉大群，ANDERSON N A，KINKEL L L.拮抗链霉菌防治马铃薯疮痂病的大田试验研究[J].植物病理学报，2000，30（3）：237-244.
[13] BERG G.Diversity of antifungal and plantassociated Serratia plymuthica strains[J].Journal of applied microbiology，2000，88（6）：952-960.
[14] SHEN S S，CHOI O H，PARK S H，et al.Root colonizing and biocontrol competency of Serratia plymuthica A214 against phytophthora blight of pepper[J].The plant pathology journal，2005，21（1）：64-67.
[15] 马迎新，刘晓光，高光祥，等.根际细菌Serratia plymuthica HROC48的生防作用初探[J].云南农业大学学报，2007，22（1）：49-53.