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【摘要】 目的 研究血清白细胞介素-12水平在广西壮族骨关节结核患者与健康体检者之间的差异及临床意义。
方法 選取2010年10月～2013年10月收治的广西壮族骨关节结核患者150例作为观察组，同期体检中心进行健康体检的165名壮族体检健康者作为对照组，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测两组外周血血清IL-12水平，常规方法测定红细胞沉降率（ESR）和血浆C反应蛋白（CRP）水平，比较两组间IL-12、ESR、CRP水平的差异，分析观察组患者IL-12水平与ESR、CRP水平的相关性。
结果 两组IL-12、ESR及CRP水平比较差异均有统计学意义（P<0.01），观察组IL-12显著低于对照组，ESR及CRP水平显著高于对照组。观察组患者血清IL-12水平与ESR水平及CRP水平均无明显线性相关（P>0.05）。
结论 广西壮族骨关节结核患者血清IL-12水平低于正常人群，IL-12可能在骨关节结核的发病中起免疫调节作用。
【关键词】 骨关节结核；白细胞介素-12；壮族
中图分类号：R529.2 文献标识码：A
【Abstract】 Objective To explore the difference of serum IL-12 levels between patients with bone and joint tuberculosis and healthy individuals in Guangxi and its clinical significance.
Methods 150 cases of bone and joint tuberculosis admitted to hospital from October，2010 to October，2013 in Guangxi were selected as observation group.And 165 healthy individuals who underwent physical examination in physical examination center in the same period were selected as control group.Levels of serum IL-12 in peripheral blood of both groups were measured by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Levels of erythrocyte sedimentation rate （ESR） and plasma C reactive protein （CRP） were tested by routine method.Then，differences of IL-12，ESR and CRP levels were compared，and the correlation of IL-12 between ESR and CRP levels were observed and analysed between groups.
Results Difference of levels of serum IL-12，ESR and CRP of both groups was statistically significant（P<0.01），serum IL-12 level of the observation group was significantly lower than that of the control group，but ESR and CRP levels were significantly higher than those of the control group.Levels of ESR and CRP were not linearly correlated with the serum IL-12 level in the observation group（P>0.05）.
Conclusion The serum IL-12 level of patients with bone and joint tuberculosis is lower than that of healthy individuals in Guangxi.IL-12 may play a role of immunoregulation in the pathogenesis of bone and joint tuberculosis.
【Key words】 bone and joint tuberculosis；Interleukin-12，Zhuang ethic group
骨关节结核（bone and joint tuberculosis）是最常见的肺外结核之一，如诊疗不及时，极易导致病灶部位组织受到破坏，后期可出现关节畸形、窦道及瘘管的形成，并有高达10%的截瘫率，目前其发病机制尚未明确。白细胞介素-12（interleukin12，IL-12）是一种具有多种生物活性和免疫调节功能的异戊二聚体细胞因子，由抗原提呈细胞、树突细胞、巨噬细胞或B细胞产生，亚基分别由IL-12A基因和IL-12B基因编码[1]。研究[2，3]证实，IL-12参与了肺结核的免疫调节，在肺结核的发生和发展中起重要作用。本研究通过酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测150例广西壮族骨关节结核患者及165例壮族健康体检者的血清IL-12表达水平，结合其红细胞沉降率（ESR）及血浆C反应蛋白（CRP）水平进行相关性分析，以探讨IL-12在骨关节结核发病中的作用。 1 对象与方法
1.1 研究对象
选取2010年10月～2013年10月右江民族医学院附属医院收治的广西壮族骨关节结核患者150例作为观察组，其中男109例，女49例，年龄7～76岁，平均（40.95±16.67）岁。随机选取同期右江民族医学院附属医院体检中心进行健康体检的165名壮族体检健康者作为对照组，其中男97例，女68例，年龄18～71岁，平均（39.53±14.39）岁，各项临床及实验室检查指标均正常。两组受试人群间的性别、年龄比较差异均无统计学意义（P>005），具有可比性。
1.2 病例纳入标准与排除标准
纳入标准：未曾接受过任何抗结核药物治疗，术后病理诊断均为骨关节结核。受试对象籍贯均为广西，受试者之间无可查亲缘关系，向上追溯3代均为壮族的个体，且长期在广西居住。排除标准：若合并以下情况之一者均不纳入研究：从未进行卡介苗接种、患有或曾患有活动性肺结核、长期使用激素、患有或曾患有其他脏器结核病、合并影响机体免疫状态的疾病、HIV感染、罹患自身免疫性疾病、合并遗传性疾病者。
1.3 研究方法
1.3.1 标本采集
用促凝管和枸橼酸钠抗凝管于清晨分别抽取受试者肘正中静脉血4 ml和2 ml，其中4 ml非抗凝血分离血清后用于IL-12及CRP水平检测；2 ml抗凝血用于ESR水平检测。
1.3.2 血清IL-12水平检测
IL-12 ELISA试剂盒为武汉华美生物工程有限公司提供的人白介素-12（IL-12/P70）ELISA Kit，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。
1.3.3 ESR及CRP检测
使用意大利Test 1全自动血沉分析仪检测ESR水平，使用日本7600全自动生化分析仪检测CRP水平，以上指标检测质控均符合英国RIQAS国际质控标准。
1.4 统计学方法
采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，相关性采用Pearson相关分析法，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 两组IL-12、ESR及CRP水平的比较
两组IL-12、ESR及CRP水平比较差异均有统计学意义（P<0.01），观察组IL-12显著低于对照组，ESR及CRP水平显著高于对照组。见表1。
2.2 观察组患者血清IL-12与ESR及CRP的相关性
经Pearson线性相关性分析，观察组患者血清IL-12水平与ESR水平无明显相关性（r=-0.115，P>0.05），观察组患者血清IL-12水平与CRP水平无明显相关性（r=-0.083，P>0.05）。
3 讨 论
结核病的发病与进展取决于机体自身的免疫状态，而T淋巴细胞介导的细胞免疫反应在抗结核免疫中占主导作用，CD4+辅助性T细胞可分为Th1细胞和Th2细胞，体内Th1/Th2应答及细胞因子失衡与结核病的发生、发展密切相关[4]。作为最具有代表性的Th1细胞因子之一，IL-12处于Th1/Th2免疫应答的核心地位，在机体结核分枝杆菌感染早期的固有免疫和后期的抗原特异性的适应性免疫之间建立起有效的关联[5]：①结核分枝杆菌侵入机体后，抗原提呈细胞合成并分泌IL-12，诱导CD4+初始 T 细胞（Th0）优先向Th1细胞分化并促进Th1细胞分泌IFN-γ这一重要的免疫调节因子。研究表明，在75%的结核性肉芽肿中，IFN-γ和IL-12同时表达阳性[6]。②IL-12能激活NK细胞并增强其细胞毒作用，活化巨噬细胞并诱导其成熟，提高其在细胞内的杀菌能力[7]。③IL-12还能抑制Th2细胞因子（如IL-4）的产生，削弱Th2细胞因子对Th1细胞因子的抑制作用，以維持Thl/Th2平衡的方式参与调节机体的抗结核免疫功能，在结核杆菌侵入机体后产生保护性免疫反应[8]。Verbon等[9]研究发现在肺结核患者中，痰涂片结核杆菌阳性患者较阴性患者血清IL-12水平显著降低。国内奚莹等人[10]的研究也表明肺结核患者血清IL-12水平显著低于健康人群，而经正规抗结核化疗后其血清水平明显上升，IL-12与肺结核活动性密切相关，其水平可作为临床工作中了解患者免疫状态，判断肺结核活动性和病情转归的参考依据。
当前国内外关于血清IL-12表达水平与结核病相关的研究主要集中在肺结核上，与骨关节结核相关的研究鲜有报道，因此，本研究采用ELISA法对150例广西壮族骨关节结核患者及健康对照组进行了血清IL-12表达水平的检测，旨在探讨IL-12在骨关节结核发病中的作用。结果显示，广西壮族骨关节结核患者的血清IL-12表达水平明显低于健康对照组（P<0.01），这与Verbon[9]及奚莹等人[10]的研究结果相同，提示骨关节结核的发生也可能与Th1为主的免疫抑制有关。骨关节结核患者感染结核分枝杆菌时可能机体细胞免疫功能低下，不能形成有效的抗结核免疫反应清除病菌而致病，以此推测骨关节结核患者体内IL-12水平降低导致机体对抗结核分枝杆菌的保护性免疫力也随之降低，Th1/Th2的平衡被打破，进而导致骨关节结核的发生。这一推测也有待今后进一步多因子及多方面的实验研究去证实。我们同时检测了两组人群的ESR及CRP水平，发现骨关节结核患者ESR及CRP水平较对照组均明显升高（P<0.01），提示骨关节结核病变呈活动性炎症性反应，本研究未发现血清IL-12水平与ESR水平或CRP水平有明显相关性，考虑骨关节结核患者机体IL-12水平与ESR、CRP水平可能有其各自的调控机制，由于影响ESR及CRP水平的因素较多，机制复杂，指标缺乏特异性，因此IL-12水平与两者无明显线性相关并不能否定IL-12在骨关节结核发生与进展中的重要作用。 总之，IL-12是一个有效的增强宿主抵御结核分枝杆菌感染的免疫调节细胞因子，本研究发现血清IL-12表达水平在骨关节结核患者中明显下调，提示IL-12可能与骨关节结核的发生密切相关，在机体抗结核免疫中可能发挥重要作用，随着IL-12以及结核病病因研究的进一步深入，血清IL-12表达水平的检测也有望成为骨关节结核预防、诊断及判断疗效和预后的重要参考指标。
参 考 文 献
[1] Vignali DA，Kuchroo VK.IL-12 family cytokines： immunological playmakers[J].Nat Immunol，2012，13（8）：722-728.
[2] Singhal J，Agrawal N，Vashishta M，et al.Suppression of dendritic cell-mediated responses by genes in calcium and cysteine protease pathways during Mycobacterium tuberculosis infection[J].J Biol Chem，2012，287（14）：11108-11121.
[3] Peresi E，Oliveira LR，da Silva WL，et al.Cytokine Polymorphisms，Their Influence and Levels in Brazilian Patients with Pulmonary Tuberculosis during Antituberculosis Treatment[J].Tuberc Res Treat，2013，2013：285094.
[4] Prezzemolo T，Guggino G，La Manna MP，et al.Functional Signatures of Human CD4 and CD8 T Cell Responses to Mycobacterium tuberculosis[J].Front Immunol，2014，5：180.
[5] 陈 敬，董德琼，杨渝浩，等.白细胞介素12对结核病患者TH1/TH2平衡的影响[J].中华结核和呼吸杂志，2002，25（5）：292-295.
[6] Fenhalls G，Stevens L，Bezuidenhout J，et al.Distribution of IFN-gamma， IL-4 and TNF-alpha protein and CD8 T cells producing IL-12p40 mRNA in human lung tuberculous granulomas[J].Immunology，2002，105（3）：325-335.
[7] 周 暉，范艳莹，吴长有，等.卡介苗（BCG）通过诱导IL-12产生和受体表达促进人NK细胞功能[J].细胞与分子免疫学杂志，2009，25（11）：976-979，983.
[8] 丁珍珍，杜先智.结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗的构建及其联合人IL-12表达质粒诱导的小鼠细胞免疫应答观察[J].中国免疫学杂志，2011，27（1）：15-19.
[9] Verbon A，Juffermans N，Van Deventer SJ，et al.Serum concentrations of cytokines in patients with active tuberculosis （TB） and after treatment[J]. Clin Exp Immunol，1999，115（1）：110-113.
[10] 奚 莹，王 莉.肺结核患者血清白细胞介素-12水平检测及临床意义[J].中国感染控制杂志，2012，11（2）：109-111，133.
（收稿日期：2015-02-27 修回日期：2015-04-23）
（编辑：梁明佩）
方法 選取2010年10月～2013年10月收治的广西壮族骨关节结核患者150例作为观察组，同期体检中心进行健康体检的165名壮族体检健康者作为对照组，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测两组外周血血清IL-12水平，常规方法测定红细胞沉降率（ESR）和血浆C反应蛋白（CRP）水平，比较两组间IL-12、ESR、CRP水平的差异，分析观察组患者IL-12水平与ESR、CRP水平的相关性。
结果 两组IL-12、ESR及CRP水平比较差异均有统计学意义（P<0.01），观察组IL-12显著低于对照组，ESR及CRP水平显著高于对照组。观察组患者血清IL-12水平与ESR水平及CRP水平均无明显线性相关（P>0.05）。
结论 广西壮族骨关节结核患者血清IL-12水平低于正常人群，IL-12可能在骨关节结核的发病中起免疫调节作用。
【关键词】 骨关节结核；白细胞介素-12；壮族
中图分类号：R529.2 文献标识码：A
【Abstract】 Objective To explore the difference of serum IL-12 levels between patients with bone and joint tuberculosis and healthy individuals in Guangxi and its clinical significance.
Methods 150 cases of bone and joint tuberculosis admitted to hospital from October，2010 to October，2013 in Guangxi were selected as observation group.And 165 healthy individuals who underwent physical examination in physical examination center in the same period were selected as control group.Levels of serum IL-12 in peripheral blood of both groups were measured by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Levels of erythrocyte sedimentation rate （ESR） and plasma C reactive protein （CRP） were tested by routine method.Then，differences of IL-12，ESR and CRP levels were compared，and the correlation of IL-12 between ESR and CRP levels were observed and analysed between groups.
Results Difference of levels of serum IL-12，ESR and CRP of both groups was statistically significant（P<0.01），serum IL-12 level of the observation group was significantly lower than that of the control group，but ESR and CRP levels were significantly higher than those of the control group.Levels of ESR and CRP were not linearly correlated with the serum IL-12 level in the observation group（P>0.05）.
Conclusion The serum IL-12 level of patients with bone and joint tuberculosis is lower than that of healthy individuals in Guangxi.IL-12 may play a role of immunoregulation in the pathogenesis of bone and joint tuberculosis.
【Key words】 bone and joint tuberculosis；Interleukin-12，Zhuang ethic group
骨关节结核（bone and joint tuberculosis）是最常见的肺外结核之一，如诊疗不及时，极易导致病灶部位组织受到破坏，后期可出现关节畸形、窦道及瘘管的形成，并有高达10%的截瘫率，目前其发病机制尚未明确。白细胞介素-12（interleukin12，IL-12）是一种具有多种生物活性和免疫调节功能的异戊二聚体细胞因子，由抗原提呈细胞、树突细胞、巨噬细胞或B细胞产生，亚基分别由IL-12A基因和IL-12B基因编码[1]。研究[2，3]证实，IL-12参与了肺结核的免疫调节，在肺结核的发生和发展中起重要作用。本研究通过酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测150例广西壮族骨关节结核患者及165例壮族健康体检者的血清IL-12表达水平，结合其红细胞沉降率（ESR）及血浆C反应蛋白（CRP）水平进行相关性分析，以探讨IL-12在骨关节结核发病中的作用。 1 对象与方法
1.1 研究对象
选取2010年10月～2013年10月右江民族医学院附属医院收治的广西壮族骨关节结核患者150例作为观察组，其中男109例，女49例，年龄7～76岁，平均（40.95±16.67）岁。随机选取同期右江民族医学院附属医院体检中心进行健康体检的165名壮族体检健康者作为对照组，其中男97例，女68例，年龄18～71岁，平均（39.53±14.39）岁，各项临床及实验室检查指标均正常。两组受试人群间的性别、年龄比较差异均无统计学意义（P>005），具有可比性。
1.2 病例纳入标准与排除标准
纳入标准：未曾接受过任何抗结核药物治疗，术后病理诊断均为骨关节结核。受试对象籍贯均为广西，受试者之间无可查亲缘关系，向上追溯3代均为壮族的个体，且长期在广西居住。排除标准：若合并以下情况之一者均不纳入研究：从未进行卡介苗接种、患有或曾患有活动性肺结核、长期使用激素、患有或曾患有其他脏器结核病、合并影响机体免疫状态的疾病、HIV感染、罹患自身免疫性疾病、合并遗传性疾病者。
1.3 研究方法
1.3.1 标本采集
用促凝管和枸橼酸钠抗凝管于清晨分别抽取受试者肘正中静脉血4 ml和2 ml，其中4 ml非抗凝血分离血清后用于IL-12及CRP水平检测；2 ml抗凝血用于ESR水平检测。
1.3.2 血清IL-12水平检测
IL-12 ELISA试剂盒为武汉华美生物工程有限公司提供的人白介素-12（IL-12/P70）ELISA Kit，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。
1.3.3 ESR及CRP检测
使用意大利Test 1全自动血沉分析仪检测ESR水平，使用日本7600全自动生化分析仪检测CRP水平，以上指标检测质控均符合英国RIQAS国际质控标准。
1.4 统计学方法
采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，相关性采用Pearson相关分析法，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 两组IL-12、ESR及CRP水平的比较
两组IL-12、ESR及CRP水平比较差异均有统计学意义（P<0.01），观察组IL-12显著低于对照组，ESR及CRP水平显著高于对照组。见表1。
2.2 观察组患者血清IL-12与ESR及CRP的相关性
经Pearson线性相关性分析，观察组患者血清IL-12水平与ESR水平无明显相关性（r=-0.115，P>0.05），观察组患者血清IL-12水平与CRP水平无明显相关性（r=-0.083，P>0.05）。
3 讨 论
结核病的发病与进展取决于机体自身的免疫状态，而T淋巴细胞介导的细胞免疫反应在抗结核免疫中占主导作用，CD4+辅助性T细胞可分为Th1细胞和Th2细胞，体内Th1/Th2应答及细胞因子失衡与结核病的发生、发展密切相关[4]。作为最具有代表性的Th1细胞因子之一，IL-12处于Th1/Th2免疫应答的核心地位，在机体结核分枝杆菌感染早期的固有免疫和后期的抗原特异性的适应性免疫之间建立起有效的关联[5]：①结核分枝杆菌侵入机体后，抗原提呈细胞合成并分泌IL-12，诱导CD4+初始 T 细胞（Th0）优先向Th1细胞分化并促进Th1细胞分泌IFN-γ这一重要的免疫调节因子。研究表明，在75%的结核性肉芽肿中，IFN-γ和IL-12同时表达阳性[6]。②IL-12能激活NK细胞并增强其细胞毒作用，活化巨噬细胞并诱导其成熟，提高其在细胞内的杀菌能力[7]。③IL-12还能抑制Th2细胞因子（如IL-4）的产生，削弱Th2细胞因子对Th1细胞因子的抑制作用，以維持Thl/Th2平衡的方式参与调节机体的抗结核免疫功能，在结核杆菌侵入机体后产生保护性免疫反应[8]。Verbon等[9]研究发现在肺结核患者中，痰涂片结核杆菌阳性患者较阴性患者血清IL-12水平显著降低。国内奚莹等人[10]的研究也表明肺结核患者血清IL-12水平显著低于健康人群，而经正规抗结核化疗后其血清水平明显上升，IL-12与肺结核活动性密切相关，其水平可作为临床工作中了解患者免疫状态，判断肺结核活动性和病情转归的参考依据。
当前国内外关于血清IL-12表达水平与结核病相关的研究主要集中在肺结核上，与骨关节结核相关的研究鲜有报道，因此，本研究采用ELISA法对150例广西壮族骨关节结核患者及健康对照组进行了血清IL-12表达水平的检测，旨在探讨IL-12在骨关节结核发病中的作用。结果显示，广西壮族骨关节结核患者的血清IL-12表达水平明显低于健康对照组（P<0.01），这与Verbon[9]及奚莹等人[10]的研究结果相同，提示骨关节结核的发生也可能与Th1为主的免疫抑制有关。骨关节结核患者感染结核分枝杆菌时可能机体细胞免疫功能低下，不能形成有效的抗结核免疫反应清除病菌而致病，以此推测骨关节结核患者体内IL-12水平降低导致机体对抗结核分枝杆菌的保护性免疫力也随之降低，Th1/Th2的平衡被打破，进而导致骨关节结核的发生。这一推测也有待今后进一步多因子及多方面的实验研究去证实。我们同时检测了两组人群的ESR及CRP水平，发现骨关节结核患者ESR及CRP水平较对照组均明显升高（P<0.01），提示骨关节结核病变呈活动性炎症性反应，本研究未发现血清IL-12水平与ESR水平或CRP水平有明显相关性，考虑骨关节结核患者机体IL-12水平与ESR、CRP水平可能有其各自的调控机制，由于影响ESR及CRP水平的因素较多，机制复杂，指标缺乏特异性，因此IL-12水平与两者无明显线性相关并不能否定IL-12在骨关节结核发生与进展中的重要作用。 总之，IL-12是一个有效的增强宿主抵御结核分枝杆菌感染的免疫调节细胞因子，本研究发现血清IL-12表达水平在骨关节结核患者中明显下调，提示IL-12可能与骨关节结核的发生密切相关，在机体抗结核免疫中可能发挥重要作用，随着IL-12以及结核病病因研究的进一步深入，血清IL-12表达水平的检测也有望成为骨关节结核预防、诊断及判断疗效和预后的重要参考指标。
参 考 文 献
[1] Vignali DA，Kuchroo VK.IL-12 family cytokines： immunological playmakers[J].Nat Immunol，2012，13（8）：722-728.
[2] Singhal J，Agrawal N，Vashishta M，et al.Suppression of dendritic cell-mediated responses by genes in calcium and cysteine protease pathways during Mycobacterium tuberculosis infection[J].J Biol Chem，2012，287（14）：11108-11121.
[3] Peresi E，Oliveira LR，da Silva WL，et al.Cytokine Polymorphisms，Their Influence and Levels in Brazilian Patients with Pulmonary Tuberculosis during Antituberculosis Treatment[J].Tuberc Res Treat，2013，2013：285094.
[4] Prezzemolo T，Guggino G，La Manna MP，et al.Functional Signatures of Human CD4 and CD8 T Cell Responses to Mycobacterium tuberculosis[J].Front Immunol，2014，5：180.
[5] 陈 敬，董德琼，杨渝浩，等.白细胞介素12对结核病患者TH1/TH2平衡的影响[J].中华结核和呼吸杂志，2002，25（5）：292-295.
[6] Fenhalls G，Stevens L，Bezuidenhout J，et al.Distribution of IFN-gamma， IL-4 and TNF-alpha protein and CD8 T cells producing IL-12p40 mRNA in human lung tuberculous granulomas[J].Immunology，2002，105（3）：325-335.
[7] 周 暉，范艳莹，吴长有，等.卡介苗（BCG）通过诱导IL-12产生和受体表达促进人NK细胞功能[J].细胞与分子免疫学杂志，2009，25（11）：976-979，983.
[8] 丁珍珍，杜先智.结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗的构建及其联合人IL-12表达质粒诱导的小鼠细胞免疫应答观察[J].中国免疫学杂志，2011，27（1）：15-19.
[9] Verbon A，Juffermans N，Van Deventer SJ，et al.Serum concentrations of cytokines in patients with active tuberculosis （TB） and after treatment[J]. Clin Exp Immunol，1999，115（1）：110-113.
[10] 奚 莹，王 莉.肺结核患者血清白细胞介素-12水平检测及临床意义[J].中国感染控制杂志，2012，11（2）：109-111，133.
（收稿日期：2015-02-27 修回日期：2015-04-23）
（编辑：梁明佩）