论文部分内容阅读
摘要 [目的] 研究禽6型副粘病毒生物学特性。[方法] 从来自吉林省自然保护区的野鸭拭子中分离出1株禽6型副粘病毒（Avian paramyxovirus type 6， APMV6），进行了形态学、血清学、生物学和病毒分子生物学鉴定，测定该病毒全基因组序列，并对F和HN毒力基因进行进化分析。[结果] 成功分离鉴定出1株APMV6，命名为JL-127，基因组全长为16 236 nt，毒力基因进化结果表明，JL-127株与TW及FE株遗传关系较近，与HK株遗传关系较远。[结论] 首次对我国野鸭源APMV6分离株进行全基因组测序，并对其进行遗传进化分析。
关键词 副粘病毒；分离；毒力基因；序列分析
中图分类号 S852.65+7 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）35-12534-03
副粘病毒形态多样，有囊膜，其基因组为单股负义RNA[1]。禽副粘病毒（Avian paramyxovirus，APMV）属于副粘病毒科禽腮腺炎病毒属，其成员有9个血清型，分别为APMV1～APMV9，其中APMV1即为新城疫病毒（NDV）[2]。禽6型副粘病毒（APMV6）基因组长度为16 236 nt，结构为3’-NP-P-M-F-SH-HN-L-5’，依次编码NP、P、M、HN、SH、F和L蛋白[3]。F蛋白是病毒囊膜上的一种表面糖蛋白，其功能是使病毒囊膜与靶细胞融合，HN蛋白具有血凝素和神经氨酸酶活性，能介导病毒吸附细胞膜[4]。
APMV6能够在9～11日龄的鸡胚中繁殖，病毒粒子具有血凝活性，该病毒能引起火鸡、野鸭轻微的呼吸道症状和产蛋量下降[5]。1977年，第1株APMV6/duck/Hongkong/18/199/77（HK）在香港地区家鸭中被首次被分离[6]，其后在我国台湾（duck/Taiwan/Y1/99）、远东地区（goose/FarEast/4440/2003）及意大利等地区有分离报道。笔者从吉林省某自然保护区的野鸭中分离到1株APMV6，对其进行全基因组测序，并对毒力基因进行遗传进化分析，可为了解其基因组特点及生物学特性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料的采集和处理。
将采集的野鸭鼻拭子与泄殖腔拭子置于含有青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 μg/ml）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，在4 ℃孵育4 h；经0.22 μm滤膜过滤后，取200 μl接种9～11日龄的SPF鸡胚中，在37 ℃温箱中孵育72 h，期间弃掉死亡的鸡胚。72 h后按常规方法收集尿囊液，保存于-70 ℃备用。
1.1.2 SPF鸡胚。
SPF鸡胚，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。
1.1.3 主要试剂。 DL2000DNA Marker 和Taq DNA聚合酶，购自宝生物（大连）工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 形态学观察。
取1 ml收集的尿囊液，15 000 r/min离心10 min，弃去上清液，用100 μl PBS将沉淀物悬浮，取1滴负染，进行电镜观察。
1.2.2 细胞凝集试验。 在血凝板中每孔加入50 μl PBS，在第1个孔内加入50 μl待检尿囊液，依次倍比稀释至第11孔，最后1孔作为红细胞对照孔，每孔加入50 μl 1%鸡血红细胞，轻轻振荡均匀，室温条件下静置30 min，观察试验结果，使所有红细胞凝集的最高稀释度作为血凝（HA）判定终点。
1.2.3 样品的PCR鉴定。 取血凝检测为阳性的样品，提取总RNA，以AIV、NDV特异性引物，副粘病毒通用引物[7]进行RT-PCR检测。鉴定引物序列为：AIV-F：5’GGAATGATHGAYGGNTGGTATGG3’；AIV-R：5’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT3’；NDV-F：5’TTGATGGCAGGCCTCTTGC3’；NDV-R：5’GGAGGATGTTGGCAGCATT3’；PAR-F1：5’GAAGGITATTGTCAIAARNINTGGAC3’；PAR-F2：5’GTTGCTTCAATGGTTCARGGNGAYAA3’；PAR-R：5’GCTGAAGTTACIGGITCICCDATRTTNC3’。
1.2.4 引物的设计与合成。
根据GenBank上公布的APMV6 HK、TW、FE株全序列（GenBank登录号分别为EU622637、NC_003043和EF569970），利用Oligo6.0软件设计16对特异性引物扩增JL-127的全基因组，其中相邻的引物扩增片段需要至少200 bp的重叠区域，便于对测序片段进行拼接。引物由哈尔滨博仕生物公司合成，引物序列见表1。
1.2.5 PCR扩增。
按照OMEGA提取试剂盒提取病毒基因组RNA，经随机引物反转录获得cDNA，此cDNA作为PCR反应的模板。取5 μl cDNA，依次加入10×PCR Buffer 5 μl、2.5 mmol/L dNTP 4 μl、上、下游引物（20 pmol/L）各1 μl，Ex Taq DNA聚合酶1 μl，加水补足50 μl并混匀。通过梯度PCR确定适宜扩增条件为：95 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s； 45 ℃ 30 s；70 ℃ 1 min 30 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min。取5 μl PCR产物在1%琼脂糖上进行电泳，经鉴定后将PCR产物直接测序。为了获得准确的基因组末端序列，3’leader及5’Trailer序列利用RACE商品化试剂盒进行扩增并测序。
1.2.6 F、HN基因序列分析。
将测序结果进行有效拼接，获得JL-127株病毒全基因组序列，利用DNAStar生物软件对F、HN基因序列与已经公布的APMV1至APMV9病毒株的序列进行同源性分析，绘制进化树。 2 结果与分析
2.1 病毒分离结果
通过血凝试验、电镜观察和RT-PCR鉴定，可鉴定出JL-127为APMV6病毒。
2.2 血凝试验结果
鸡胚在接种JL-127后72 h未出现死亡，收取尿囊液进行HA试验，HA效价为23。
2.3 电镜观察结果
从图1可以看出，病毒粒子呈圆形或椭圆形，表面有囊膜，直径为200～350 nm。
2.4 病毒全基因组测序
将各段PCR产物测序结果进行拼接（图2），获得JL-127的全基因组序列，全长为16 236 nt，GenBank登录号为KF267717；与此前报道的HK、TW、FE株全基因组长度相同，符合“6碱基原则”。基因组结构为3’leader-NP-P-M-F-SH-HN-L-Trailer5’，与HK、TW、FE株的氨基酸及核苷酸比对结果见表2。
2.5 F和HN基因进化分析
从GenBank数据库上获得APMV1～APMV9 的F和HN氨基酸序列，与JL-127的F和HN基因氨基酸序列构建进化树，分析发现JL-127属于APMV6血清型，与TW和FE遗传关系较近，与HK遗传关系较远（图3）。
3 讨论
在禽副粘病毒中，NDV能够引起家禽严重的病症，因此受到广泛的研究与关注，而对APMV2-9的相关研究报道却很少，这对于了解及防控副粘病毒的蔓延是极为不利的。笔者在2011年1次样品采集中，分离到1株野鸭源的APMV6，经测序获得其基因组信息，经氨基酸及核苷酸比对发现该株病毒属于APMV6血清型，且与TW 和FE株病毒的同源性较高，均达到90%以上，说明该病毒变异小。另外，鸡胚接种试验表明该病毒致病力弱，暂时没有大规模爆发和蔓延的危险。笔者首次获得我国野鸭源APMV6全基因组序列，为今后对APMV6的生态分布及遗传进化关系研究奠定基础，也为禽副粘病毒各血清型间遗传进化及变异规律提供数据支持。
参考文献
[1]
LAMB R A，PARKS G D.Paramyxoviridae：the viruses and their replication[M]//KNIPE D M，HOWLEY P M.
Fields Virology.5th end.Philadelphia：Lippincott Williams and Wilkins，2007：1449-1496.
[2] LAMB R A，COLLINS P L，KOLAKOFSKY D，et al.Virus Taxonomy：classification and nomenclature of viruses.The eighth report of the international committee in taxonomy of viruses[M].USA：Elsevier Academic Press，2005.
[3] CHANG P C，HSIEH M L，SHIEN J H，et al.Complete nucleotide sequence of avian paramyxovirus type 6 isolated from ducks [J].J Gen Virol，2001，82（9）：2157-2168.
[4] ALEXANDER D J.Newcastle disease and other avian paramyxoviruses[J].Rev Sci Tech，2009，19（2）：443-462.
[5] ALEXANDER D J.Newcastle disease and other avian paramyxoviridae infections[M].Ames：Iowa State University Press，1997：541-569.
[6] SHORTRIDGE K F，ALEXANDER D J，COLLINS M S.Isolation and properties of viruses from poultry in HongKong which represent a new （sixth） distinct group of avian paramyxoviruses[J].J Gen Virol，1980，49（2）：255-262.
[7] TONG S X，CHERN S W，LI Y，et al.Sensitive and broadly reactive reverse transcription-PCR assays to detect novel paramyxoviruses [J].J Clin Microbiol，2008，46（8）：2652-2658.
关键词 副粘病毒；分离；毒力基因；序列分析
中图分类号 S852.65+7 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）35-12534-03
副粘病毒形态多样，有囊膜，其基因组为单股负义RNA[1]。禽副粘病毒（Avian paramyxovirus，APMV）属于副粘病毒科禽腮腺炎病毒属，其成员有9个血清型，分别为APMV1～APMV9，其中APMV1即为新城疫病毒（NDV）[2]。禽6型副粘病毒（APMV6）基因组长度为16 236 nt，结构为3’-NP-P-M-F-SH-HN-L-5’，依次编码NP、P、M、HN、SH、F和L蛋白[3]。F蛋白是病毒囊膜上的一种表面糖蛋白，其功能是使病毒囊膜与靶细胞融合，HN蛋白具有血凝素和神经氨酸酶活性，能介导病毒吸附细胞膜[4]。
APMV6能够在9～11日龄的鸡胚中繁殖，病毒粒子具有血凝活性，该病毒能引起火鸡、野鸭轻微的呼吸道症状和产蛋量下降[5]。1977年，第1株APMV6/duck/Hongkong/18/199/77（HK）在香港地区家鸭中被首次被分离[6]，其后在我国台湾（duck/Taiwan/Y1/99）、远东地区（goose/FarEast/4440/2003）及意大利等地区有分离报道。笔者从吉林省某自然保护区的野鸭中分离到1株APMV6，对其进行全基因组测序，并对毒力基因进行遗传进化分析，可为了解其基因组特点及生物学特性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料的采集和处理。
将采集的野鸭鼻拭子与泄殖腔拭子置于含有青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 μg/ml）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，在4 ℃孵育4 h；经0.22 μm滤膜过滤后，取200 μl接种9～11日龄的SPF鸡胚中，在37 ℃温箱中孵育72 h，期间弃掉死亡的鸡胚。72 h后按常规方法收集尿囊液，保存于-70 ℃备用。
1.1.2 SPF鸡胚。
SPF鸡胚，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。
1.1.3 主要试剂。 DL2000DNA Marker 和Taq DNA聚合酶，购自宝生物（大连）工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 形态学观察。
取1 ml收集的尿囊液，15 000 r/min离心10 min，弃去上清液，用100 μl PBS将沉淀物悬浮，取1滴负染，进行电镜观察。
1.2.2 细胞凝集试验。 在血凝板中每孔加入50 μl PBS，在第1个孔内加入50 μl待检尿囊液，依次倍比稀释至第11孔，最后1孔作为红细胞对照孔，每孔加入50 μl 1%鸡血红细胞，轻轻振荡均匀，室温条件下静置30 min，观察试验结果，使所有红细胞凝集的最高稀释度作为血凝（HA）判定终点。
1.2.3 样品的PCR鉴定。 取血凝检测为阳性的样品，提取总RNA，以AIV、NDV特异性引物，副粘病毒通用引物[7]进行RT-PCR检测。鉴定引物序列为：AIV-F：5’GGAATGATHGAYGGNTGGTATGG3’；AIV-R：5’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT3’；NDV-F：5’TTGATGGCAGGCCTCTTGC3’；NDV-R：5’GGAGGATGTTGGCAGCATT3’；PAR-F1：5’GAAGGITATTGTCAIAARNINTGGAC3’；PAR-F2：5’GTTGCTTCAATGGTTCARGGNGAYAA3’；PAR-R：5’GCTGAAGTTACIGGITCICCDATRTTNC3’。
1.2.4 引物的设计与合成。
根据GenBank上公布的APMV6 HK、TW、FE株全序列（GenBank登录号分别为EU622637、NC_003043和EF569970），利用Oligo6.0软件设计16对特异性引物扩增JL-127的全基因组，其中相邻的引物扩增片段需要至少200 bp的重叠区域，便于对测序片段进行拼接。引物由哈尔滨博仕生物公司合成，引物序列见表1。
1.2.5 PCR扩增。
按照OMEGA提取试剂盒提取病毒基因组RNA，经随机引物反转录获得cDNA，此cDNA作为PCR反应的模板。取5 μl cDNA，依次加入10×PCR Buffer 5 μl、2.5 mmol/L dNTP 4 μl、上、下游引物（20 pmol/L）各1 μl，Ex Taq DNA聚合酶1 μl，加水补足50 μl并混匀。通过梯度PCR确定适宜扩增条件为：95 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s； 45 ℃ 30 s；70 ℃ 1 min 30 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min。取5 μl PCR产物在1%琼脂糖上进行电泳，经鉴定后将PCR产物直接测序。为了获得准确的基因组末端序列，3’leader及5’Trailer序列利用RACE商品化试剂盒进行扩增并测序。
1.2.6 F、HN基因序列分析。
将测序结果进行有效拼接，获得JL-127株病毒全基因组序列，利用DNAStar生物软件对F、HN基因序列与已经公布的APMV1至APMV9病毒株的序列进行同源性分析，绘制进化树。 2 结果与分析
2.1 病毒分离结果
通过血凝试验、电镜观察和RT-PCR鉴定，可鉴定出JL-127为APMV6病毒。
2.2 血凝试验结果
鸡胚在接种JL-127后72 h未出现死亡，收取尿囊液进行HA试验，HA效价为23。
2.3 电镜观察结果
从图1可以看出，病毒粒子呈圆形或椭圆形，表面有囊膜，直径为200～350 nm。
2.4 病毒全基因组测序
将各段PCR产物测序结果进行拼接（图2），获得JL-127的全基因组序列，全长为16 236 nt，GenBank登录号为KF267717；与此前报道的HK、TW、FE株全基因组长度相同，符合“6碱基原则”。基因组结构为3’leader-NP-P-M-F-SH-HN-L-Trailer5’，与HK、TW、FE株的氨基酸及核苷酸比对结果见表2。
2.5 F和HN基因进化分析
从GenBank数据库上获得APMV1～APMV9 的F和HN氨基酸序列，与JL-127的F和HN基因氨基酸序列构建进化树，分析发现JL-127属于APMV6血清型，与TW和FE遗传关系较近，与HK遗传关系较远（图3）。
3 讨论
在禽副粘病毒中，NDV能够引起家禽严重的病症，因此受到广泛的研究与关注，而对APMV2-9的相关研究报道却很少，这对于了解及防控副粘病毒的蔓延是极为不利的。笔者在2011年1次样品采集中，分离到1株野鸭源的APMV6，经测序获得其基因组信息，经氨基酸及核苷酸比对发现该株病毒属于APMV6血清型，且与TW 和FE株病毒的同源性较高，均达到90%以上，说明该病毒变异小。另外，鸡胚接种试验表明该病毒致病力弱，暂时没有大规模爆发和蔓延的危险。笔者首次获得我国野鸭源APMV6全基因组序列，为今后对APMV6的生态分布及遗传进化关系研究奠定基础，也为禽副粘病毒各血清型间遗传进化及变异规律提供数据支持。
参考文献
[1]
LAMB R A，PARKS G D.Paramyxoviridae：the viruses and their replication[M]//KNIPE D M，HOWLEY P M.
Fields Virology.5th end.Philadelphia：Lippincott Williams and Wilkins，2007：1449-1496.
[2] LAMB R A，COLLINS P L，KOLAKOFSKY D，et al.Virus Taxonomy：classification and nomenclature of viruses.The eighth report of the international committee in taxonomy of viruses[M].USA：Elsevier Academic Press，2005.
[3] CHANG P C，HSIEH M L，SHIEN J H，et al.Complete nucleotide sequence of avian paramyxovirus type 6 isolated from ducks [J].J Gen Virol，2001，82（9）：2157-2168.
[4] ALEXANDER D J.Newcastle disease and other avian paramyxoviruses[J].Rev Sci Tech，2009，19（2）：443-462.
[5] ALEXANDER D J.Newcastle disease and other avian paramyxoviridae infections[M].Ames：Iowa State University Press，1997：541-569.
[6] SHORTRIDGE K F，ALEXANDER D J，COLLINS M S.Isolation and properties of viruses from poultry in HongKong which represent a new （sixth） distinct group of avian paramyxoviruses[J].J Gen Virol，1980，49（2）：255-262.
[7] TONG S X，CHERN S W，LI Y，et al.Sensitive and broadly reactive reverse transcription-PCR assays to detect novel paramyxoviruses [J].J Clin Microbiol，2008，46（8）：2652-2658.