【摘 要】
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我国果胶酶制剂使用广泛但专一性不高,高效、专一的果胶酶制剂在市场上仍然匮乏.利用基因工程技术改造果胶酶生产菌株——黑曲霉来生产单一成分的果胶酶成为解决果胶酶应用需
【机 构】
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天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室天津市工业微生物重点实验室 天津300457
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我国果胶酶制剂使用广泛但专一性不高,高效、专一的果胶酶制剂在市场上仍然匮乏.利用基因工程技术改造果胶酶生产菌株——黑曲霉来生产单一成分的果胶酶成为解决果胶酶应用需求的一种有效方案.构建一种高效的CRISPR-Cas9基因编辑技术,可为构建高产单一性果胶酶的黑曲霉底盘菌株提供有效的基因编辑工具.首先敲除产果胶酶黑曲霉基因组上的pyrG基因构建尿嘧啶营养缺陷型菌株An△pyrG,并在An△pyrG菌株的pyrG基因位点定点整合Cas9基因表达盒和pyrG基因表达盒,构建组成型表达Cas9基因的黑曲霉菌株AnCas9,再构建含有gpdA启动子、锤头结构核酶、HDV核酶的稳定性表达sgRNA的pLM2-sgRNA质粒,建立CRISPR-Cas9基因编辑体系.利用该技术失活AnCas9菌株中的2个聚半乳糖醛酸酶基因4978020和4983861来检测构建的CRISPR-Cas9基因编辑效率并检测4978020基因功能缺失菌株的表型变化和产酶变化,结果表明果胶酶基因编辑效率大于50％,An△4978020的表型和果胶酶酶活性与出发菌株均无明显变化.在黑曲霉中成功构建了高效的Cas9基因编辑技术,4978020基因功能缺失也不影响菌株表型,为构建高产单一性果胶酶黑曲霉底盘菌株奠定基础.
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